通過干涉PtGlim1a基因表達培育低木質素含量717楊樹的方法技術

本發明專利技術公開了一種通過干涉PtGlim1a基因表達培育低木質素含量717楊樹的方法，該方法包括如下步驟：克隆楊樹木質素合成基因PtGlim1a；構建含有楊樹木質素合成基因PtGlim1a的重組載體pK2GW7(I)_antiPtGlim1a；構建含表達載體pK2GW7(I)_antiPtGlim1a的農桿菌菌株；將上述農桿菌菌株轉化717楊樹。本發明專利技術干擾717楊樹自身PtGlim1a基因的表達，從而得到了低木質素含量。低木質素含量的717楊樹可廣泛應用到造紙領域，減少能源的消耗和有毒物質的使用，降低造紙成本，減少環境污染。717楊樹對環境的適應性好，易種植成本低。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于分子生物學和生物
，更加具體的說，涉及一種楊樹木質素合成基因及表達載體及應用。
技術介紹
木質素是地球上數量僅次于纖維素的有機物，林木中木質素占木材干重的15～36％，木質素生物合成及調節在植物生長和發育中發揮重要作用。另外，木質素是制漿造紙業的不利因素，脫除纖維素中的木質素，需要消耗大量能源和使用有毒化學物質，提高了造紙成本并污染環境。近十幾年來，人們對木質素生物合成也有了更多更深入的認識，隨著木質素生物合成途徑許多酶的編碼基因被不斷分離克隆出來，通過調控木質素生物合成途徑中重要酶的編碼基因的表達，抑制酶的活性，從而阻斷木質素生物合成途徑，降低木質素的合成量或單體組成，己經在一些轉基因植株上取得了成功。因此，利用生物技術手段降低木質素含量或改變其制漿性能，創造出符合制漿造紙原料特性要求的林木品種，對于降低制漿造紙的經濟成本和環境保護等方面都具有重要意義。
技術實現思路
本專利技術的目的是克服現有技術的不足，提供一種通過干涉PtGlim1a基因表達培育低木質素含量717楊樹的方法。本專利技術的技術方案概述如下：通過干涉PtGlim1a基因表達培育低木質素含量717楊樹的方法，包括如下步驟：(1)克隆楊樹木質素合成基因PtGlim1a；所述基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；(2)構建含有楊樹木質素合成基因PtGlim1a的重組載體pK2GW7(I)_antiPtGlim1a；(3)構建含表達載體pK2GW7(I)_antiPtGlim1a的農桿菌菌株；(4)將步驟(3)的農桿菌菌株轉化717楊樹。本專利技術的優點：本專利技術將PtGlim1a序列反向插入至pK2GW7(I)載體，構建了pK2GW7(I)_antiPtGlim1a高效表達載體，通過農桿菌菌株(C58)導入到717楊樹中，干擾717楊樹自身PtGlim1a基因的表達，從而得到了低木質素含量717楊樹。低木質素含量的717楊樹可以廣泛應用到造紙領域，減少能源的消耗和有毒物質的使用，降低造紙成本，減少環境污染。717楊樹對環境的適應性好，易種植成本低，可以為大規模的造紙提供性質優良的原材料。附圖說明圖1是楊樹木質素合成基因PtGlim1a克隆電泳示意圖。圖2是包含本專利技術的楊樹木質素合成基因PtGlim1a的表達載體pK2GW7(I)_antiPtGlim1a示意圖。圖3是pK2GW7(I)_antiPtGlim1a轉化農桿菌C58PCR篩選結果。圖4是PtGlim1a轉基因717楊樹半定量PCR結果。圖5是PtGlim1a轉基因717楊樹莖段切片結果。圖6是PtGlim1a轉基因717楊樹木質素含量測定結果。具體實施方式實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件以及手冊中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。717楊樹為歐洲山楊×銀白楊(Populus tremula×P.alba INRA clone N717 1-B4，簡稱717楊樹)。下面結合具體實施例進一步說明本專利技術的技術方案。實施例1楊樹木質素合成基因PtGlim1a的克隆、反義表達載體的構建及含有反義表達載體的農桿菌菌株的獲得。首先，以采一年生的毛果楊(Populus trichocarpa)為原料，利用基因克隆技術，獲取楊樹木質素合成基因PtGlim1a。取一年生毛果楊(Populus trichocarpa)的形成層，使用植物RNeasy Plant Mini Kit(Trans gene Code#EP101-01 50rxns)提取total RNA，并且利用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(Trans gene Code#AE301-03 100rxns)去除基因組DNA干擾，反轉錄出cDNA。根據NCBI數據庫中LIM基因的保守區設計引物SEQ ID No.3：5'-CATGGATCCTCTTCAAGGGAGAACAAGGA-3'和SEQ ID No.4：5'-CGGGAGCTCGCCATGTATGGTAGGAAGGA -3'然后利用RACE-PCR技術(Introgen,RLM-RACE Kit with Manual)獲得楊樹PtGlim1a基因全長cDNA序列，其具體步驟如下：1)cDNA第一鏈的合成用反轉錄試劑盒TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0，以毛果楊形成層總RNA為模板，Oligo(dT)為引物，在AMV逆轉錄酶的作用下合成cDNA第一鏈，反轉錄體系如下：反應條件：42℃60min，99℃5min。2).楊樹木質素合成基因PtGlim1a反轉錄質量PCR擴增檢測用楊樹Actin基因特異引物SEQ ID No.5:5'–TGGTGACGCTGGTATGGTTA-3',SEQ ID No.6：5'-TCCTTCTTGTCCACGCTCTT-3'，PCR擴增，以驗證反轉錄反應及RNA質量。PCR反應體系如下：反應條件：94℃3min；94℃30s，40℃30s，72℃50s，35cycles；72℃5min。3)楊樹木質素合成基因PtGlim1a片段的PCR擴增以cDNA為模板，以SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示核苷酸為上下游引物，進行PCR反應。反應體系如下：PCR反應條件：94℃3min；94℃30s，40℃30s，72℃60s，35cycles；72℃5min。PCR結束后，取5μl PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳。對通過RACE技術擴增得到的楊樹木質素合成基因PtGlim1a進行測序分析，得到完整的楊樹木質素合成基因PtGlim1a全長為588bp(SEQ ID No.1)，見圖1。由楊樹木質素合成基因PtGlim1a編碼的蛋白質，是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。4)根據楊樹木質素合成基因PtGlim1a核苷酸序列中的高特異性部分設計上下游引物用于PtGlim1a基因的半定量鑒定。SEQ ID No.7:5'-GGTAGGAAGGACATGAAAAG-3'SEQ ID No.8:5'-ATCCAGTCGTCAGCATCACT-3'構建反義表達載體時，則分別在特異性引物的5’端添加Gateway系統重組位點，SEQ ID No.9:5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3’SEQ ID No.10:5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3’得到：SEQ ID No.11:5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGGTAGGAAGGACATGAAAAG-3'SEQ ID No.12:5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT ATCCAGTCGTCAGCATCACT-3'5)attB-PCR產物的合成及純化回收PCR離心管中加入以下反應體系PCR反應條件為:95℃，5min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，90s；72℃，10min；4℃，∞。PCR反應結束后，取1μL PCR產物進行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，檢測PCR產物的質量，其余用作產物的純化回收。6)構建含有楊樹木質素合成基因PtGli本文檔來自技高網...

【技術保護點】
通過干涉PtGlim1a基因表達培育低木質素含量717楊樹的方法，其特征是包括如下步驟：(1)克隆楊樹木質素合成基因PtGlim1a；所述基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO.1所示；(2)構建含有楊樹木質素合成基因PtGlim1a的重組載體pK2GW7(I)_antiPtGlim1a；(3)構建含表達載體pK2GW7(I)_antiPtGlim1a的農桿菌菌株；(4)將步驟(3)的農桿菌菌株轉化717楊樹。

【技術特征摘要】
1.通過干涉PtGlim1a基因表達培育低木質素含量717楊樹的方法，其特征是包括如下步驟：(1)克隆楊樹木質素合成基因PtGlim1a；所述基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；(2)構建含有楊...

【專利技術屬性】
技術研發人員：楊少輝，祝桂媛，王潔華，
申請(專利權)人：天津大學，
類型：發明
國別省市：天津;12