結核分枝桿菌抗原蛋白Rv0446c及其T細胞表位肽的應用制造技術

本發明專利技術涉及結核分枝桿菌抗原蛋白Rv0446c及其T細胞表位肽在制備結核病檢測試劑、疫苗和藥物中的應用，所述抗原蛋白Rv0446c及其T細胞表位肽的氨基酸序列分別如SEQ?ID?NO:1?5所示。本發明專利技術利用結核分枝桿菌Rv0446c蛋白抗原及其T細胞表位肽作為刺激物用于結核分枝桿菌感染引起的特異性T細胞和B細胞免疫反應，與以往采用完全抗原相比，能夠降低由于抗原不純造成的假陽性。由所述Rv0446c蛋白抗原及其表位肽制備的檢測試劑可廣泛用于結核病的輔助診斷、流行病學監測等相關領域，Rv0446c蛋白抗原及其表位肽制備的結核疫苗和抗結核藥物可用于結核病的預防和治療。

Application of Mycobacterium tuberculosis antigen protein Rv0446c and T cell epitope peptide

The present invention relates to Mycobacterium tuberculosis antigen protein Rv0446c and T cell epitope peptide in preparing tuberculosis application detection reagents, vaccines and drugs in the amino acid sequence of the protein Rv0446c antigen and T cell epitope peptide respectively, such as SEQ ID NO:1 5 shows. The invention uses the Rv0446c protein of Mycobacterium tuberculosis antigen and T cell epitope peptide as a stimulant for specific immune T cells and B cell response caused by Mycobacterium tuberculosis infection, compared with the previous complete antigen, can reduce the false positive result caused by impure antigen. By the Rv0446c protein antigen and table peptide preparation kit can be widely used for diagnosis and epidemiological surveillance of tuberculosis and other related fields, and the Rv0446c protein antigen epitope peptide preparation of tuberculosis vaccine and anti tuberculosis drugs can be used for the prevention and treatment of tuberculosis.

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及分子生物學和免疫學領域，具體地說，涉及結核分枝桿菌抗原蛋白Rv0446c及其T細胞表位肽在結核病檢測試劑、疫苗和藥物制備中的應用。
技術介紹
結核病是由結核分枝桿菌引起的慢性傳染性疾病，調查結果顯示全世界有三分之一的人口處于潛伏感染，且有5％～10％在未來的生活中將可能發展為活動性結核病。自1993年世界衛生組織宣布結核病成為全球危機后，結核病的發病率和死亡率一直居高不下，據WHO報告，每年新增結核病人約800萬，每年約有200～300萬人死于結核病。我國在22個結核高負擔國家中位居第2位，全國第5次流行病學抽樣檢查結果顯示：全國130萬人發病，占全球發病率的14.3％，我國也是全球27個耐藥結核病高負擔國家之一，耐多藥結核病患病人數占據全球第一。每個未經治療的活動性肺結核病人能夠傳染10～15人。結核病已經成為全球重要的衛生問題，需引起人們的高度重視。結核的早期診斷和預防治療對結核病的控制至關重要，研究者應致力于開發高效、敏感、特異的結核診斷檢測方法。臨床上肺結核癥狀表現為咳嗽、咳痰、高熱等，容易與慢性支氣管炎、支氣管擴張、肺炎、感冒等混淆，需要借助影像學、細菌學、免疫學等診斷方法方可確診。臨床上常用的是細菌學方法痰涂片鏡檢和痰培養，痰涂片鏡檢是世界范圍內結核病檢查中使用最廣泛的技術，由于此法設備簡便，適合在經濟不發達的地區使用。但是由于對樣本中的菌含量要求高，因此該方法靈敏度不高，導致大量涂陰患者不被發現從而轉陽，且涂陰患者具有傳染性，不容忽視，該方法無種特異性，靈敏度差，受痰液標本和病情的影響。痰培養作為結核病診斷的金標準，但是存在培養時間過長，現在已有BACTEC MGIT960系統等快速培養系統可在2周內分離培養結核分枝桿菌，但由于其配制的培養基、營養添加劑、雜菌抑制劑價格昂貴，無法在發展中國家廣泛推廣，并且快速培養與改良L-J培養相比污染率顯著增高，導致假陽性結果出現。常用的用于人群篩查的檢測方法是皮膚結核菌素實驗，使用的是結核菌純蛋白衍生物(PPD)，由于PPD中含有許多分枝桿菌種類(致病性分枝桿菌、環境分枝桿菌和BCG)所共有的抗原分子，因此PPD診斷結核病的特異性較差，不能有效區分結核分枝桿菌感染與卡介苗接種，結核的影像學檢查如常規的X線檢查、CT檢查、MRI檢查、超聲檢查等價格昂貴，且對身體造成一定傷害，特異性低，不適合用于常規的檢查診斷。結核分枝桿菌侵入人體后寄居在巨噬細胞內，人體對結核分枝桿菌主要的免疫反應是細胞免疫應答，主要參與的細胞是CD4+和CD8+T細胞。CD8+T細胞可以通過穿孔素、顆粒酶等途徑將被結核分枝桿菌感染的巨噬細胞或樹突狀細胞殺死從而達到清除結核分枝桿菌的目的。其中MHC-I類分子存在于所有有核細胞的表面，而MHC-Ⅱ類分子僅存在于專職抗原遞呈細胞如巨噬細胞、樹突狀細胞等，因此CD8+T細胞表位在結核的診斷和疫苗構建中具有更廣泛的用途。目前以T細胞為基礎的檢測方法T-SPOT是利用IFN-γ特異性抗體捕獲經結核抗原刺激的外周血淋巴細胞培養后產生的IFN-γ，并以酶聯免疫斑點顯色的方式表現出來，從斑點的數量來確定細胞分泌細胞因子的情況，從單細胞水平評價細胞免疫功能。以T細胞為基礎的體外γ干擾素的檢測被用于結核病的輔助診斷，該檢測方法不僅能篩選出活動性結核病人，同時也能檢測出潛伏期病人，從而能更好的預防和控制潛伏期結核，目前已有以結核分枝桿菌基因組RD1區編碼的結核特異性抗原ESAT-6和CFP-10的全蛋白或多肽為刺激物的商品化的IGRA檢測試劑盒，如QuantiFERON-TB Gold test和T-SPOT，均呈現較高的靈敏性和特異性。而Rv0446c(GI：15607587)是結核分枝桿菌H37Rv基因組編碼的保守膜蛋白，含256個氨基酸，可在H37Rv的培養上清中檢測出的分泌蛋白，主要參與細胞壁的加工過程，是可能的結核毒力相關蛋白。Rv0446c是結核分枝桿菌保守膜蛋白，在結核分枝桿菌培養上清中能檢測到的分泌蛋白，主要參與細胞膜和細胞的加工過程，利用生物信息學軟件對其進行抗原表位預測分析，發現Rv0446c蛋白存在較多的T細胞表位，具有潛在的診斷效能。本專利技術建立在反向疫苗學的基礎上，利用計算機篩選出結核分枝桿菌可能的免疫原性抗原庫，然后利用生物信息學軟件TE predict和IEDB預測結核抗原MHC-I類T細胞表位，通過固態合成法合成這些多肽，先利用人群免疫篩選試驗對結核新抗原進行篩選，篩選出免疫優勢抗原然后，再通過動物實驗對其免疫原性進行驗證，最后經驗證得到的免疫優勢抗原及其表位可一方面用于結核診斷，另一方面可用于卡介苗的改造。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供結核分枝桿菌抗原蛋白Rv0446c的應用。本專利技術的另一目的是提供結核分枝桿菌抗原蛋白Rv0446c T細胞表位肽及其應用。本專利技術基于以下構思：Rv0446c是結核分枝桿菌上的保守膜蛋白，基于T細胞IFN-γ釋放技術，利用生物信息學軟件TE predict和IEDB對Rv0446c編碼基因上T細胞抗原表位進行預測，利用固態合成法合成T細胞表位肽，再通過T-SPOT(T細胞斑點試驗)對結核病人、肺部其他疾病患者、健康人體內的特異性T淋巴細胞進行檢測，從而評價該抗原用于結核檢測的靈敏度和特異性，同時通過人群免疫學實驗篩選出Rv0446c抗原蛋白上的免疫優勢表位肽，再通過動物實驗，確定免疫優勢T細胞表位肽的免疫原性。為了實現本專利技術目的，本專利技術提供結核分枝桿菌抗原蛋白Rv0446c在制備結核檢測試劑、疫苗和藥物中的應用；其中，所述抗原蛋白Rv0446c的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有相同免疫原性和相同抗原性的氨基酸序列。本專利技術還提供結核分枝桿菌抗原蛋白Rv0446c T細胞表位肽，所述表位肽選自P120、P121、P122和P123，其氨基酸序列分別如SEQ ID NO:1-4所示。本專利技術還提供由所述T細胞表位肽衍生的表位肽或其類似物。本專利技術還提供編碼所述表位肽的DNA分子。本專利技術還提供含有編碼所述表位肽的DNA分子的表達盒及表達載體。本專利技術還提供含有編碼所述表位肽的DNA分子的轉基因細胞系。本專利技術還提供含有編碼所述表位肽的DNA分子的重組菌及其表達純化的重組蛋白。本專利技術還提供所述表位肽、編碼所述表位肽的DNA分子、所述轉基因細胞系或所述重組菌及其表達純化的重組蛋白在制備結核檢測試劑、疫苗和藥物中的應用。本專利技術還提供一種結核檢測試劑，所述檢測試劑中含有結核分枝桿菌抗原蛋白Rv0446c，或編碼所述抗原蛋白Rv0446c的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重組菌產生的重組蛋白；和/或，所述表位肽、編碼所述表位肽的DNA分子和/或所述重組蛋白。本專利技術還提供含有上述檢測試劑的結核T-SPOT檢測試劑盒。所述試劑盒還包括以下材料或試劑：①一抗：抗人或動物IFN-γ的小鼠IgG單克隆抗體。②酶標試劑：辣根過氧化物酶標記的抗人或動物IFN-γ不同表位的另一種小鼠IgG單克隆抗體。③標準品：培養板：含有PVDF膜或硝酸纖維素膜的96孔微孔反應板，陽性對照孔中含有結核非特異性刺激抗原(如PHA等)，本底對照含有PBS或基底液。本文檔來自技高網...

【技術保護點】
結核分枝桿菌抗原蛋白Rv0446c在制備結核檢測試劑、疫苗和藥物中的應用；其中，所述抗原蛋白Rv0446c的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:5所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有相同免疫原性和相同抗原性的氨基酸序列。

【技術特征摘要】
1.結核分枝桿菌抗原蛋白Rv0446c在制備結核檢測試劑、疫苗和藥物中的應用；其中，所述抗原蛋白Rv0446c的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有相同免疫原性和相同抗原性的氨基酸序列。2.結核分枝桿菌抗原蛋白Rv0446c T細胞表位肽，其特征在于，所述表位肽選自如SEQ ID NO:1-4所示氨基酸序列中的一種。3.權利要求2所述表位肽在制備結核檢測試劑、疫苗和藥物中的應用。4.一種結核檢測試劑，其特征在于，所述檢測試劑中含有結核分枝桿菌抗原蛋白Rv0446c，或編碼所述抗原蛋白Rv0446c的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重組菌產生的重組蛋白；和/或，權利要求2所述表位肽，或編碼所述表位肽的DNA分子，或由含有編碼所述表位肽的DNA分子的重組菌產生的重組蛋白。5.含有權利要求4所述檢測試劑的結核T-SPOT檢測試劑盒。6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中含有：①一抗：抗人或動物IFN-γ的小鼠IgG單克隆抗體；②酶標試劑：辣根過氧化物酶標記的抗人或動物IFN-γ不同表位的另一種小鼠IgG單克隆抗體；③標準品：培養板：含有PVD...

【專利技術屬性】
技術研發人員：萬康林，王雪枝，劉海燦，李馬超，蔣毅，
申請(專利權)人：中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，
類型：發明
國別省市：北京;11