本發明專利技術公開了一種可激活肺癌細胞中抑癌基因RUNX3表達的雙鏈小激活RNA（saRNA）及其應用。該saRNA分子的功效具有特異性高、專一性強的優點，在高效激活被異常沉默的RUNX3基因表達的同時，不上調其它基因的表達，也不對正常細胞產生毒副作用。該saRNA可有力抑制肺癌細胞的增殖能力、克隆形成能力和腫瘤干細胞自我更新能力，可以用于制備安全可靠、高效的抗肺癌藥物。
SaRNA for activating expression of RUNX3 in lung cancer cells and uses thereof
The invention discloses a double chain small activation RNA (saRNA) which can activate the expression of tumor suppressor gene RUNX3 in lung cancer cells and its application. The effect of the saRNA molecule has the advantages of high specificity, high specificity, high expression of RUNX3 gene was activated in abnormal silence at the same time, the expression of other genes does not increase, does not produce toxic side effects in normal cells. The saRNA can effectively inhibit the proliferation of lung cancer cells, the ability to clone and self-renewal of tumor stem cells.
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物醫藥
，具體涉及一種激活肺癌細胞中抑癌基因RUNX3表達的雙鏈saRNA分子及其應用。
技術介紹
肺癌是名副其實的“超級殺手”，其發病率和死亡率均居各種癌癥的首位。該病早期常無明顯癥狀，相當多的患者就診時已處于中晚期并伴有轉移，喪失了手術機會，此時的治療以化療為主。但是中晚期肺癌總體對化療很不敏感，并且化療藥物具有強烈的毒副作用，對機體內的大量正常細胞，如肝細胞、腎小管上皮細胞、骨髓造血干細胞等造成巨大的毒性。研發新的肺癌治療方法和治療藥物是全球科研及臨床工作者所面臨的重大課題。近年的研究日益顯示：一些在正常細胞中本應高表達的抑癌基因，在肺癌細胞中發生轉錄沉默，這些抑癌基因的轉錄沉默是肺癌發生發展的一個重要原因。重新激活肺癌細胞中被沉默的抑癌基因的轉錄活動，就可以有力的抑制癌細胞的惡性行為，逆轉腫瘤的發生發展。這是一種安全可靠的治療肺癌的新思路。RUNX3是一種重要的抑癌基因，最初被命名為急性髓性白血病 2 基因，以后又被稱作多瘤病毒強化因子結合蛋白2基因、核心結合因子 3基因。該基因編碼的蛋白，一方面作為 Wnt 信號通路的負調控因子，與 TCF4-β-catenin 形成復合體，阻止其與 c-MYC、cyclinD1 等靶基因的啟動子區結合而抑制這些原癌基因的轉錄；另一方面作為TGF信號通路的正調控因子，與SMAD3/SMAD4協同作用上調p21 和BIM等抑癌基因的表達。在肺癌的發生發展過程中，RUNX3的轉錄常被沉默，導致癌細胞的無限增殖，使其獲得遷移、侵襲、耐藥、抗凋亡等一系列惡性行為。與基因啟動子區序列同源的雙鏈小RNA 能特異性的作用于該基因的啟動子，激活該基因的轉錄活動，從而有效上調其表達，這類雙鏈小RNA被稱為小激活RNA (saRNA)。本專利技術針對肺癌細胞中被異常沉默的抑癌基因RUNX3，首次設計合成了作用于其啟動子區-385 bp至 -361 bp 的saRNA，有效激活了肺癌細胞中RUNX3 的表達。
技術實現思路
本專利技術公開了一種可激活肺癌細胞中抑癌基因RUNX3表達的雙鏈saRNA分子及其在研究領域和醫藥領域中的應用。本專利技術公開的saRNA為一種新的RNA序列，將該saRNA轉染肺癌細胞，可以有力抑制肺癌細胞的增殖能力、克隆形成能力和腫瘤干細胞自我更新能力。該saRNA為以下雙鏈RNA分子中的任意一種：正義鏈5’ -GCCCGCGGGGCUCCUAGCCCGCCC- 3’反義鏈5’ -GGGCGGGCUAGGAGCCCCGCGGGC- 3’；或正義鏈：5’ -GCCCGCGGGGCUCCUAGCCCGCCCtt -3’反義鏈：5’ -GGGCGGGCUAGGAGCCCCGCGGGCtt -3’。本專利技術提出了一種saRNA重組質粒，該saRNA重組質粒包含前面所述的任意一種雙鏈saRNA分子的序列。利用這樣的重組質粒轉染肺癌細胞，能夠有效的激活RUNX3基因的表達，抑制肺癌細胞增殖，從而能夠有效的治療肺癌。本專利技術提出了一種激活RUNX3轉錄的試劑盒，所述試劑盒包含前面所述的任意一種雙鏈saRNA分子或saRNA重組質粒。利用本專利技術的試劑盒能夠有效的激活肺癌細胞中RUNX3基因的表達。本專利技術提出了一種抗肺癌藥物，該藥物含有有效量的saRNA分子或saRNA重組質粒，該抗肺癌藥物可以采用常規方法制備成相應制劑，可通過皮下、肌肉、靜脈和局部等途徑給藥。本專利技術具有特異性高、專一性強的優點，能夠高效的激活肺癌細胞中被沉默的抑癌基因RUNX3的表達，在激活RUNX3表達的同時，不上調其它基因的表達，對正常細胞無毒害作用，是一種安全可靠、高效的抗肺癌手段。附圖說明圖1是化學合成的saRNA轉染人肺癌細胞SK-MES-1、H460、H446和A549后，實時熒光定量PCR檢測RUNX3 mRNA表達量的結果。圖中：縱坐標表示相對于未處理組的RUNX3 mRNA相對表達量；橫坐標表示未處理組、陰性對照組（NC），轉染30 nmol/L、60 nmol/L、90 nmol/L和120 nmol/L saRNA組。 圖2是WesternBlot檢測saRNA轉染SK-MES-1、H460和H446細胞后，RUNX3蛋白的表達量，NC指陰性對照組，saRNA指轉染90 nmol/L saRNA組。圖3是化學合成的saRNA轉染人肺癌細胞SK-MES-1、H460和H446后，MTT法檢測saRNA對肺癌細胞增殖能力的影響。圖中：縱坐標表示相對于陰性對照組的相對增殖率；橫坐標表示轉染saRNA的濃度。 圖4是90 nmol/L saRNA轉染人肺癌細胞SK-MES-1、H460和H446后，對肺癌細胞克隆形成能力的影響。圖 5 是90 nmol/L saRNA轉染人肺癌細胞SK-MES-1、H460和H446后，對肺癌細胞懸浮成球能力的影響。具體實施方式為了使本專利技術的目的及優點更加清楚明白，以下結合實施例對本專利技術進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本專利技術，并不用于限定本專利技術。實施例1：saRNA激活RUNX3 基因的轉錄。步驟一、試劑及其試劑準備，以下實施例中，所使用的儀器：熒光定量PCR儀（ABI 7500）；PCR儀（Biometra, T1 Thermobycler）；細胞培養箱（Thermo）等。材料和試劑：RNAiMate (genepharma)，RPMI 1640培養基(Gibco)，Trizol (天根)，反轉錄試劑盒 (DRR014A PrimeScript?, TaKaRa)，SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa）24 孔培養板（Nunc）等。PCR引物：RUNX3正向引物：5' -CAGCACCACAAGCCACTTCA- 3'RUNX3反向引物：5' -GGTCGGAGAATGGGTTCAGTT- 3'GAPDH正向引物：5' -TGTCCCCACTGCCAACGTGTCA- 3'GAPDH反向引物：5' -GCGTCAAAGGTGGAGGAGTGGGT- 3'。步驟二、化學合成saRNA 根據RUNX3啟動子轉錄起始位點上游 385 bp至 361 bp的序列，設計saRNA: 正義鏈：5' -GCCCGCGGGGCUCCUAGCCCGCCCtt- 3' 反義鏈：5' -GGGCGGGCUAGGAGCCCCGCGGGCtt- 3'將該序列在人類基因組數據庫中比對，確定沒有與它相同的其它序列。步驟三、熒光定量PCR檢測RUNX3 mRNA表達水平。 S31、細胞培養：人肺癌細胞SK-MES-1、H460、H446和A549培養于含10％FBS的RPMI 1640培養基中，37℃、5％CO2培養箱培養。 S32、細胞鋪板并轉染：將四種癌細胞以3.5×104個/孔接種到24孔培養板中，每種細胞均設置未處理組、陰性對照組、30 nmol/L saRNA組、60 nmol/L saRNA組、90 nmol/L saRNA組和120 nmol/L saRNA組。37℃、5％CO2培養箱培養過夜，無雙抗無血清的培養基中，按siRNA-MateTM說明書中的步驟，將合成的saRNA按相應的劑量本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種激活肺癌細胞中RUNX3基因表達的雙鏈saRNA分子，包括以下雙鏈RNA分子中的任意一種：正義鏈5'??GCCCGCGGGGCUCCUAGCCCGCCC??3'反義鏈5'??GGGCGGGCUAGGAGCCCCGCGGGC??3'；或正義鏈：5'??GCCCGCGGGGCUCCUAGCCCGCCCtt??3'反義鏈：5'??GGGCGGGCUAGGAGCCCCGCGGGCtt??3'。
【技術特征摘要】
1.一種激活肺癌細胞中RUNX3基因表達的雙鏈saRNA分子，包括以下雙鏈RNA分子中的任意一種：正義鏈5' -GCCCGCGGGGCUCCUAGCCCGCCC- 3'反義鏈5' -GGGCGGGCUAGGAGCCCCGCGGGC- 3'；或正義鏈：5' -GCCCGCGGGGCUCCUAGCCCGCCCtt- 3'反義鏈：5' -GGGCGGGCUAGGA...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王振飛，朝魯門其其格，王玲，馬大光，楊永雁，李穎，王丹婷，韓雅玲，孫秋穎，
申請(專利權)人：內蒙古醫科大學附屬人民醫院，
類型：發明
國別省市：內蒙古;15
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