棉花細(xì)胞色素P450 CYP94C1基因在抗黃萎病中的應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及棉花細(xì)胞色素P450?CYP94C1基因在抗黃萎病中的應(yīng)用專利申請(qǐng)。所述GbCYP94C1基因，與植物的黃萎病抗性相關(guān)。發(fā)明專利技術(shù)人發(fā)現(xiàn)在植物受到黃萎病菌侵染時(shí)，該基因表達(dá)量出現(xiàn)了表達(dá)量降低的明顯變化，而在采用部分類型的激素處理時(shí)，該基因的表達(dá)量則又出現(xiàn)了表達(dá)量升高的明顯變化。進(jìn)一步將該基因沉默后，植物的抗黃萎病抗性得到了提升，而該基因超表達(dá)后，植物對(duì)黃萎病菌侵染時(shí)更為敏感。基于上述特性，通過培育或者篩選CYP94C1基因沉默的植株，可為獲得黃萎病抗性較好植物新品種提供較好借鑒和參考，因而在植物新品種培育方面具有較好地應(yīng)用價(jià)值。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于基因工程
，具體涉及棉花細(xì)胞色素P450 CYP94C1基因在抗黃萎病中的應(yīng)用專利申請(qǐng)。
技術(shù)介紹
植物與病原菌的抗?fàn)幍男盘?hào)途徑中，主要有兩個(gè)信號(hào)途徑：一個(gè)是微生物/病原相關(guān)分子模式的識(shí)別（MAMP）；另一個(gè)是植物激素信號(hào)途徑的調(diào)控，主要包括水楊酸（SA）信號(hào)途徑、茉莉酸（JA）信號(hào)途徑和乙烯（ET）信號(hào)途徑。微生物/病原相關(guān)分子模式的識(shí)別（microbe/pathogen-associated molecular patterns，MAMPs）是植物的固有免疫防御系統(tǒng)，且以膜錨定模式識(shí)別受體（membrane-anchored pattern recognition receptors，PRRs）為其識(shí)別受體。在植物激素信號(hào)途徑調(diào)控過程中，植物防御病原微生物的入侵是通過一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的，它通過調(diào)控植物激素來實(shí)現(xiàn)植物的防御反應(yīng)，它們通過調(diào)節(jié)局部的和系統(tǒng)的防御機(jī)制抵抗入侵的病原菌。不同的激素系統(tǒng)之間的相互作用，使植物對(duì)一個(gè)特定模式的病原體感染做出響應(yīng)。棉花黃萎病是一種通過土壤傳播的真菌類維管束病害，被稱為棉花中的“癌癥”，是棉花中最普遍但損害又最嚴(yán)重的病害。棉花被黃萎病菌入侵后，導(dǎo)致棉花葉片松弛，萎黃和壞疽；莖部維管束褐化；花和果實(shí)減少。黃萎病菌之所以難以防治是由于病菌的休眠生物體的存活率較高且寄主范圍具有廣泛性。一旦真菌進(jìn)入木質(zhì)部后殺菌劑將很難將其消除。大麗輪枝菌和黑白輪枝菌是已發(fā)現(xiàn)的引起棉花黃萎病的主要的兩種致病菌，其中，在主要的棉花種植區(qū)域中，大麗輪枝菌是棉花黃萎病的主要致病菌。自從1935年棉花黃萎病病菌在中國(guó)被發(fā)現(xiàn)以來，國(guó)內(nèi)越來越重視對(duì)黃萎病的研究。然而，傳統(tǒng)的抗病育種策略很難篩選出大量的抗病種質(zhì)資源，進(jìn)展緩慢；化學(xué)方法雖有成效但是對(duì)環(huán)境破壞嚴(yán)重。隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，通過把一些抗病基因轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)，進(jìn)而獲得轉(zhuǎn)基因植株，從而提高植株本身的遺傳抗性來抵御病菌的入侵，因而基因工程也被認(rèn)為抗病育種研究中最有潛力的技術(shù)。P450s是一個(gè)超基因大家族酶系，關(guān)于所有生物體的細(xì)胞色素P450基因的命名規(guī)則已經(jīng)在蛋白序列的同源性和系統(tǒng)發(fā)育基礎(chǔ)上建立起來了。根據(jù)氨基酸序列的相似性對(duì)P450s進(jìn)行分類，如果氨基酸序列相似性低于20%，則屬于不同的家族，命名為CYP1、CYP2、CYP3等，以CYP1為例，當(dāng)氨基酸序列相似性大于40%時(shí)歸為同一家族，命名為CYP1，當(dāng)氨基酸序列相似性大于55%時(shí)歸為同一亞家族，命名為CYP1A（A，B，C）。然而，這一命名規(guī)則還是有一些缺陷的，尤其是在植物中，因?yàn)榛虻膹?fù)制和重組會(huì)使一個(gè)簡(jiǎn)單的命名變得復(fù)雜，在這種情況下，則根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行家族分配。植物細(xì)胞色素P450命名范圍是從CYP71A1到CYP99XY，以及CYP701A1和之后的基因。植物細(xì)胞色素P450初步分為兩類：A-type和non-A-type。多數(shù)的P450s參與一些物質(zhì)和次級(jí)代謝物的合成，且進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)它們均屬于A-type類，而non-A-type類的P450s的功能主要是參與脂質(zhì)或植物激素的代謝。由于植物細(xì)胞色素P450基因功能的多樣性和重要性，因而對(duì)其與黃萎病間的作用機(jī)制也有必要加以研究，從而為黃萎病的預(yù)防和控制提供一定的借鑒和參考。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)目的在于提供棉花細(xì)胞色素P450 CYP94C1基因在抗黃萎病中的新應(yīng)用，利用該新用途，可培育新的抗黃萎病的棉花新品種，從而為棉花黃萎病的預(yù)防和控制提供新的途徑。本專利技術(shù)所采取的技術(shù)方案詳述如下。棉花細(xì)胞色素P450 CYP94C1基因在抗黃萎病中的應(yīng)用，所述棉花細(xì)胞色素P450 CYP94C1基因，表示為：GbCYP94C1基因，其全長(zhǎng)cDNA序列含1653 bp，genbank編號(hào)為kp323405，該基因與植物的黃萎病抗性相關(guān)。進(jìn)一步而言，棉花在受黃萎病菌侵染時(shí)，GbCYP94C1基因的表達(dá)量會(huì)發(fā)生降低；棉花在受到MeJA、JA和GA處理時(shí)，GbCYP94C1基因的表達(dá)量會(huì)發(fā)生提高；而GbCYP94C1基因的表達(dá)不受ABA處理的影響；更進(jìn)一步而言，GbCYP94C1基因通過JA信號(hào)途徑響應(yīng)植物的傷害反應(yīng)。所述GbCYP94C1基因，與植物的黃萎病抗性相關(guān)，在將該基因沉默后，植物的黃萎病抗性有所增強(qiáng)，而將該基因超表達(dá)后，植物對(duì)黃萎病菌侵染更為敏感；所述植物具體為棉花或者擬南芥等。本專利技術(shù)首先克隆獲得了棉花P450 CYP94C1基因，并對(duì)該基因結(jié)構(gòu)、所表達(dá)蛋白等相關(guān)信息進(jìn)行了深入研究。在對(duì)該基因與植物的黃萎病相關(guān)性研究時(shí)，專利技術(shù)人發(fā)現(xiàn)在植物受到黃萎病菌侵染時(shí)，該基因表達(dá)量出現(xiàn)了表達(dá)量降低的明顯變化，而在采用部分類型的激素處理時(shí)，該基因的表達(dá)量則又出現(xiàn)了表達(dá)量升高的明顯變化。進(jìn)一步將該基因沉默后，植物的抗黃萎病抗性得到了提升，而該基因超表達(dá)后，植物對(duì)黃萎病菌侵染時(shí)更為敏感。基于上述特性，通過培育或者篩選CYP94C1基因沉默的植株，可為獲得黃萎病抗性較好植物新品種提供較好借鑒和參考，因而在植物新品種培育方面具有較好地應(yīng)用價(jià)值。附圖說明圖1為GbCYP94C1基因的克隆和菌液PCR檢測(cè)的電泳圖，其中a：GbCYP94C1基因克隆的瓊脂糖凝膠電泳圖；b：菌液PCR檢測(cè)的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M表示Marker，N表示陰性對(duì)照，P表示陽性對(duì)照，1-3表示3個(gè)單菌落；圖2為GbCYP94C1與其他同源性序列的蛋白比對(duì)結(jié)果，其中著色線部分包含有K螺旋保守結(jié)構(gòu)域和血紅素結(jié)合區(qū)域；圖3為GbCYP94C1蛋白的進(jìn)化樹分析，其中所選物種有棉花（Gb），擬南芥（At），煙草（Nt），丹參（Sm），蠶豆（Vs）和矮牽牛（Pe）；圖中GenBank登錄號(hào)分別為AtCYP94B1（Q9FMV7.1），AtCYP94B2（NP_566155.1），AtCYP94B3（Q9SMP5.1），AtCYP94C1（Q9ZUX1.1），AtCYP94D1（NP_174713.1），AtCYP94D2（NP_191222.1），VsCYP94A1（AF030260.1），VsCYP94A2（AF092917.1），VsCYP94A3（AF092914.1），NtCYP94A4（AF092915.1），NtCYP94A5（AF092916.1），NtCYP94A6（AF092913.1），PeCYP94A13（AAZ39645.1），SmCYP94C54（KP337727.1），SmCYP94C55（AJD25222.1），其中GbCYP94C1與SmCYP94C54的親緣性關(guān)系最近，相似性高達(dá)56.4%；圖4為GbCYP94C1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果；圖5為黃萎病菌誘導(dǎo)時(shí)GbCYP94C1基因的表達(dá)變化情況，其在棉花幼苗長(zhǎng)出兩片真葉時(shí)接種黃萎病，然后分別在不同時(shí)間點(diǎn)取樣做GbCYP94C1基因的表達(dá)模式分析，黃萎病病菌的菌液濃度為105 spores/mL；圖6為GbCYP94C1基因在棉花幼苗中不同組織根、莖和葉中的表達(dá)量；圖7為激素誘導(dǎo)情況下GbCYP94C1基因的表達(dá)變化情況；圖8為VIGS技術(shù)干涉效率的分析鑒定，其中a：棉花基因GbCLA通過病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)（VIGS）使基因沉默后的表型；b：qRT-PCR和RT-PCR技術(shù)分別檢測(cè)本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
棉花細(xì)胞色素P450?CYP94C1基因在抗黃萎病中的應(yīng)用，其特征在于，所述GbCYP94C1基因，其全長(zhǎng)cDNA序列含1653?bp，genbank編號(hào)為kp323405，該基因與植物的黃萎病抗性相關(guān)。

【技術(shù)特征摘要】
1.棉花細(xì)胞色素P450 CYP94C1基因在抗黃萎病中的應(yīng)用，其特征在于，所述GbCYP94C1基因，其全長(zhǎng)cDNA序列含1653 bp，genbank編號(hào)為kp323405，該基因與植物的黃萎病抗性相關(guān)。2.如權(quán)利要求1所述棉花細(xì)胞色素P450 CYP94C1基因在抗黃萎病中的應(yīng)用，其特征在于，在受黃萎病菌侵染時(shí)，GbCYP94C1基因的表達(dá)量會(huì)發(fā)生降低。3.如權(quán)利要求1所述棉花細(xì)胞色素P450 CYP94C1基因在抗黃萎病中的應(yīng)用，其特征在于，在受到MeJA、JA和...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：蔡應(yīng)繁，周克學(xué)，龍璐，王微娜，孫全，高巍，張驍，宋純鵬，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：河南大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：河南;41