一種培養秈稻愈傷組織的方法技術

本發明專利技術公開了一種培養秈稻愈傷組織的方法，該方法以滬旱1B、滬旱11B、旱恢3號、旱恢7號、滬旱15等5個秈稻品種為材料，分別研究了相同培養基不同光照條件下秈稻品種愈傷組織誘導率、愈傷生長量及分化率的差異，以及相同光照條件不同培養基的秈稻品種愈傷誘導率、愈傷生長量及分化率的差異。結果表明，不同光照條件下，各品種出愈率及愈傷生長量的差異極顯著，分化率差異顯著；光下秈稻愈傷的出愈率平均在92％以上，暗下出愈率平均也在85％以上，比一般培養方案的出愈率高出2?3倍。不同培養基條件下，秈稻初生愈傷的誘導率差異不顯著，生長量差異顯著。秈稻基因型是造成各品種培養力差異顯著的主要原因。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于農業
，具體地說，涉及一種培養秈稻愈傷組織的方法。
技術介紹
隨著大規模的水稻基因組測序的結束和水稻序列圖譜的繪制，基因組數據庫中積累了大量的數據，功能基因組的研究已經被提上議事日程。基因工程將會成為后基因組時代基因功能驗證的必須手段，而不僅僅只是應用研究的工具。因此，如何建立一套穩定、高效的轉化系統就顯得非常重要。理想的外植體的獲得是建立水稻高效轉化系統的前提。近年來的研究表明，水稻的幼胚、幼穗、成熟胚以及花藥等的愈傷組織都可以作為轉基因的理想受體。其中，幼胚因為出愈率高、胚性好被認為是最理想的轉化受體，但其取材受季節限制，操作復雜費時費力且易污染，從而限制了其在基因工程中應用的持續性。一般認為，成熟胚誘導效率不高、繼代易褐化、胚性不好，尤以秈稻更甚。但已有的一些研究表明，對誘導和繼代條件適當優化，來源于成熟胚的愈傷組織仍可獲得良好的效果。而且成熟胚取材不受季節限制、操作簡便，可以持續不斷地提供轉化受體，如果能摸索條件提高秈稻愈傷的誘導率和生活力，使其在基因工程中得到更廣泛的應用，勢必將會促進功能基因組學和基因工程本身的發展。自1902年德國植物學家G1Haberlandt提出細胞全能性(Totipotency)理論之后，經過科學家們50余年的不斷試驗,植物細胞的全能性得到了充分論證,建立在此基礎上的植物組織培養技術也得到了迅速發展。水稻的組織培養始于1955年Akio等進行的根尖培養,之后又相繼進行了幼胚、節、種子、葉鞘、胚乳及葉片等離體再生培養研究。1968年日本科學家H1Niizeki等首次獲得水稻花培植株,隨后廣大水稻育種工作者對花藥培養技術進行了不斷的探索研究。我國水稻花藥培養研究始于1970年,于1975年育成水稻花培新品種新秀、花育1號和中花2號等水稻花培新品種并很快應用于生產,顯示了花培育種在農業上應用的潛力。“七五”計劃期間,在中國科學院和中國農業科學院的共同主持下,有組織地開展全國協作,“七五”攻關結束時,協作組培育并通過種子部門審定的花培品種有5個,其中由中國農業科學院李梅芳等育成了中花系列,如“中花8號”和“中花9號”等粳稻品種,在京津唐地區推廣萬畝以上；北京市農林科學院育成的京花101,黑龍江省合江水稻所育成的合江21等花培品種也都分別作為當地推廣品種。我國科學家在水稻花藥培養、單倍體育種方面進行了大量的工作,不僅改進了培養技術,并對小孢子再生的花粉植株的細胞學與遺傳學、雄核發育、細胞分化與形態發生以及一些機理問題作了研究,從而大幅度提高了花粉植株的誘導頻率,為花藥培養在水稻品種改良的應用打下了堅實的基礎。近年來,水稻轉基因研究取得了長足進展。然而,大部分已獲得成功轉化的品種均為粳稻,占整個水稻品種80％以上的秈稻品種,則因為愈傷組織誘導和植株再生率低而遺傳轉化困難。目前在秈稻組織培養技術中存在的問題是秈稻成熟胚誘導效率不高、繼代易褐化、胚性不好，因而影響了其在水稻育種的應用。水稻作為中國最主要的糧食作物，而現有水稻品種的產量與品質還不能滿足人們日益提高的生活水平需要，因而改進與提高現有水稻品種的產量與品質仍是育種工程的主要課題。傳統的作物遺傳育種方法為水稻產量的提高和品質的改善做出了重要貢獻。而今后水稻的進一步遺傳改良除了堅持常規的育種方法外，將細胞和組織培養技術、轉基因育種技術等應用于水稻育種將是現代作物育種發展的必然趨勢。成熟胚培養取材方便，不受季節的限制，水稻遺傳育種中具有廣闊的應用前景。但是到現在為止，對于占我國水稻種植面積80％的秈稻而言，適合不同秈稻品種的高效組織培養體系還未建立，特別是秈稻品種成熟胚的組織培養效果不佳，進行基因轉化的難度明顯大于粳稻。
技術實現思路
本專利技術的目的在于克服上述技術存在的缺陷，提供一種培養秈稻愈傷組織的方法，該方法以6種重要的秈稻品種為材料，研究了不同培養條件對其愈傷誘導力及分化力的影響，以期為建立高效的秈稻成熟胚受體系統奠定基礎。其具體技術方案為：一種培養秈稻愈傷組織的方法，包括以下步驟：步驟1、秈稻成熟種子的消毒將水稻秈稻品種滬旱1B、滬旱11B、旱恢3號、旱恢7號、滬旱15中飽滿成熟的種子經手工去殼或機器脫粒，選擇色白、色純、飽滿的米粒用75％的酒精消毒一分鐘，再用1.5％的次氯酸鈉消毒20-25分鐘，放在搖床上搖，用無菌水沖洗4-5次；步驟2、不同光照培養條件下誘導秈稻初生愈傷及其分化①將滬旱1B、旱恢7號、滬旱15的種子經消毒后，分別放在加有濾紙的無菌培養皿中置于超凈工作臺上吹干，然后分別接種到NB的誘導培養基上，每個培養瓶接10-12粒，接好的種子一部分放在30℃的暗箱中培養，另一部分放在30℃的光培室中培養，光培的時間為每天8:00-22:00，10天后分別統計各水稻品種各處理的出愈率；②統計完出愈率后，將誘導成功的愈傷組織分離出來直接轉移到分化培養基上，每瓶轉移愈傷組織6塊并置于25℃的光照條件下進行分化，分化期間的光照強度為2000Lx,光照時間為每天14h，25-30天后分別統計各種水稻品種各處理的分化率；步驟3、不同誘導培養基條件下誘導秈稻初生愈傷及其分化①將滬旱11B、旱恢3號的種子經消毒后分別放在加有濾紙的無菌培養皿中置于超凈工作臺上吹干，然后每個品種分別接到NB、MB、JAJB的誘導培養基上，每瓶接10粒，并放在30℃的光照條件下培養，光照時間為每天8:00-22:00，培養10天后分別統計各品種各處理的出愈率；②統計完出愈率后，將誘導成功的愈傷組織分離出來直接轉移到分化培養基上，每瓶轉移愈傷組織8塊并置于25℃的光照條件下進行分化，分化期間的光照強度為2000Lx,光照時間為每天14h，25-30天后分別統計各種水稻品種各處理的分化率。步驟4、方差分析利用Excel軟件中數據分析功能，進行無重復雙因素方差分析和顯著性檢驗。進一步，所述出愈率的計算具體為：出愈率＝(產生愈傷組織的種胚數/接種的種胚數)×100％；每種處理初生愈傷的重量統計具體為：初生愈傷的重量統計用的是Excel軟件統計，統計各秈稻品種愈傷組織的總塊數和愈傷組織的總鮮重，然后計算各品種愈傷組織重量的平均值；所述分化率的計算具體為：綠苗分化率＝(產生綠苗的愈傷組織塊數/轉移的愈傷組織塊數)×100％。進一步，誘導培養基：滬旱1B、旱恢7號、滬旱15用NB培養基+2，4-D 2.5mg/L，旱恢3號、滬旱11B每種均用三種培養基，分別為NB培養基+2，4-D 2.5mg/L，MB培養基+2，4-D 2.5mg/L，JAJB培養基+2，4-D 2.5mg/L，這三種培養基除了母液不同外，其他成分均按照JAJB的來配；分化培養基：MS+NAA 0.2mg/L+IAA 0.2mg/L+KT 2mg/L+6-BA 2mg/L；預培養基：1/2MS+2，4-D 3mg/L+水解酪蛋白0.6g/L+麥芽糖20g/L+瓊脂6.8g/L；篩選培養基：H7-1C、1B-2A用MB培養基+2，4-D 2.0mg/L，滅菌后加抗生素Carb 500mg/L和Basta 20mg/L；HH15用NB培養基+2，4-D 2.0mg/L，滅菌后加抗生素。進一步，NB基本培養基配方：N6大量Ⅰ(50倍)2本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種培養秈稻愈傷組織的方法，其特征在于，包括以下步驟：步驟1、秈稻成熟種子的消毒將水稻秈稻品種滬旱1B、滬旱11B、旱恢3號、旱恢7號、滬旱15中飽滿成熟的種子經手工去殼或機器脫粒，選擇色白、色純、飽滿的米粒用75％的酒精消毒一分鐘，再用1.5％的次氯酸鈉消毒20?25分鐘，放在搖床上搖，用無菌水沖洗4?5次；步驟2、不同光照培養條件下誘導秈稻初生愈傷及其分化①將滬旱1B、旱恢7號、滬旱15的種子經消毒后，分別放在加有濾紙的無菌培養皿中置于超凈工作臺上吹干，然后分別接種到NB的誘導培養基上，每個培養瓶接10?12粒，接好的種子一部分放在30℃的暗箱中培養，另一部分放在30℃的光培室中培養，光培的時間為每天8:00?22:00，10天后分別統計各水稻品種各處理的出愈率；②統計完出愈率后，將誘導成功的愈傷組織分離出來直接轉移到分化培養基上，每瓶轉移愈傷組織6塊并置于25℃的光照條件下進行分化，分化期間的光照強度為2000Lx,光照時間為每天14h，25?30天后分別統計各種水稻品種各處理的分化率；步驟3、不同誘導培養基條件下誘導秈稻初生愈傷及其分化①將滬旱11B、旱恢3號的種子經消毒后分別放在加有濾紙的無菌培養皿中置于超凈工作臺上吹干，然后每個品種分別接到NB、MB、JAJB的誘導培養基上，每瓶接10粒，并放在30℃的光照條件下培養，光照時間為每天8:00?22:00，培養10天后分別統計各品種各處理的出愈率；②統計完出愈率后，將誘導成功的愈傷組織分離出來直接轉移到分化培養基上，每瓶轉移愈傷組織8塊并置于25℃的光照條件下進行分化，分化期間的光照強度為2000Lx,光照時間為每天14h，25?30天后分別統計各種水稻品種各處理的分化率；步驟4、方差分析利用Excel軟件中數據分析功能，進行無重復雙因素方差分析和顯著性檢驗。...

【技術特征摘要】
1.一種培養秈稻愈傷組織的方法，其特征在于，包括以下步驟：步驟1、秈稻成熟種子的消毒將水稻秈稻品種滬旱1B、滬旱11B、旱恢3號、旱恢7號、滬旱15中飽滿成熟的種子經手工去殼或機器脫粒，選擇色白、色純、飽滿的米粒用75％的酒精消毒一分鐘，再用1.5％的次氯酸鈉消毒20-25分鐘，放在搖床上搖，用無菌水沖洗4-5次；步驟2、不同光照培養條件下誘導秈稻初生愈傷及其分化①將滬旱1B、旱恢7號、滬旱15的種子經消毒后，分別放在加有濾紙的無菌培養皿中置于超凈工作臺上吹干，然后分別接種到NB的誘導培養基上，每個培養瓶接10-12粒，接好的種子一部分放在30℃的暗箱中培養，另一部分放在30℃的光培室中培養，光培的時間為每天8:00-22:00，10天后分別統計各水稻品種各處理的出愈率；②統計完出愈率后，將誘導成功的愈傷組織分離出來直接轉移到分化培養基上，每瓶轉移愈傷組織6塊并置于25℃的光照條件下進行分化，分化期間的光照強度為2000Lx,光照時間為每天14h，25-30天后分別統計各種水稻品種各處理的分化率；步驟3、不同誘導培養基條件下誘導秈稻初生愈傷及其分化①將滬旱11B、旱恢3號的種子經消毒后分別放在加有濾紙的無菌培養皿中置于超凈工作臺上吹干，然后每個品種分別接到NB、MB、JAJB的誘導培養基上，每瓶接10粒，并放在30℃的光照條件下培養，光照時間為每天8:00-22:00，培養10天后分別統計各品種各處理的出愈率；②統計完出愈率后，將誘導成功的愈傷組織分離出來直接轉移到分化培養基上，每瓶轉移愈傷組織8塊并置于25℃的光照條件下進行分化，分化期間的光照強度為2000Lx,光照時間為每天14h，25-30天后分別統計各種水稻品種各處理的分化率；步驟4、方差分析利用Excel軟件中數據分析功能，進行無重復雙因素方差分析和顯著性檢驗。2.根據權利要求1所述的培養秈稻愈傷組織的方法，其特征在于，所述出愈率的計算具體為：出愈率＝(產生愈傷組織的種胚數/接種的種胚數)×100％；每種處理初生愈傷的重量統計具體為：初生愈傷的重量統計用的是Excel軟件統計，統計各秈稻品種愈傷組織的總塊數和愈傷組織的總鮮重，然后計算各品種愈傷組織重量的平均值；所述分化率的計算具體為：綠苗分化率＝(產生綠苗的愈傷組織塊數/轉移的愈傷組織塊數)×100％。3.根據權利要求1所述的培養秈稻愈傷組織的方法，其特征在于...

【專利技術屬性】
技術研發人員：胡頌平，張琳，吳云花，毛偉偉，吳仙花，余霞，
申請(專利權)人：江西農業大學，
類型：發明
國別省市：江西;36