一種診斷豬臍帶血偽狂犬病毒野毒株的Taqman實時熒光PCR試劑盒及其用途制造技術

本發明專利技術公開了一種診斷豬臍帶血偽狂犬病毒野毒株的Taqman實時熒光PCR試劑盒及其用途。所述試劑盒包括一對引物和一條特異性熒光探針，所述引物的序列如SEQ?ID?NO:1以及SEQ?ID?NO:2所示，所述熒光探針的序列如SEQ?ID?NO:3所示。本發明專利技術的試劑盒能夠特異性的診斷豬臍帶血偽狂犬病毒野毒株，并具有較高的靈敏度，重復性優，可以精準評估和診斷母豬偽狂犬病毒帶毒排毒、仔豬感染情況，還可開展偽狂犬疾病的凈化和效果評估等，具有十分廣泛的應用價值。同時本發明專利技術的試劑盒檢測過程中需要儀器設備相對簡單，檢測過程簡便，檢測時間短；結果相對可靠，不易污染；技術操作要求低，可以在基層大量推廣；可以相對容易質量控制，易于標準化。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及分子診斷
，特別涉及一種診斷豬臍帶血偽狂犬病毒野毒株的Taqman實時熒光PCR試劑盒及其用途。
技術介紹
豬偽狂犬病毒(PRV)可以引起多種家畜及野生動物的偽狂犬病(Pesudorabies,PR)。該病對豬的危害極其嚴重，主要臨床癥狀為引起妊娠母豬流產、產生木乃伊胎、死胎及產弱仔等。對于哺乳仔豬及斷奶期仔豬則會有高燒、呼吸困難并伴專利技術顯中樞神經障礙的癥狀，感染后死亡率可達100％。豬偽狂犬病當前常用的診斷方法：(1)血清中和試驗(serum neutraliza-tiontest,SN)，是目前大多數國家檢測偽狂犬病的主要方法之一。SN特異性很強，敏感性較低。SN的普及主要是基于其檢測能力可以給血清樣本的抗體量作一個大致的定量分析。(2)酶聯免疫吸附試驗(Enzyme-linked immuno-sorbent assay,ELISA)。現在已經有商業化的ELISA診斷試劑盒在市場上銷售，該方法敏感性高，且操作簡單快捷，目前在世界上多個國家作為基礎診斷方法。(3)乳膠凝集試驗(latexagglutination test，LAT)。LAT的敏感性和特異性與ELISA方法一致，均可現場應用，可運用于進行快速的血清篩選檢測，并可檢查早期感染。(4)聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)。PCR敏感性高、特異性強、檢測速度快(24h出結果)，現在已經作為偽狂犬病原檢測的常用方法之一。上述4種方法中，血清中和試驗的特異性和敏感性均高于其他檢測方法，但由于其要求高、周期長，故在大批量的樣品檢測上不如ELISA試驗和乳膠凝集試驗的操作簡單快捷。同時血清學檢測技術(SN、LAT和ELISA)存在以下缺點：(1)對豬群中存在的免疫耐受現象評估較難，相對不能更加有效、直觀和高精準反映豬群的抗體水平。(2)血樣采集需要多人協助，且需要特殊設備，采集過程相對比較費時。PCR技術快速敏感，但由于偽狂犬gE基因GC含量很高，相對比較難以擴增，且一般臨床檢測樣品(臍帶血中)無法檢測到該基因，就無法使用普通PCR技術進行疾病診斷野毒株。另外PCR檢測偽狂犬樣品存在以下缺點：(1)需要復雜的儀器設備：核酸提取儀器、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統和分析軟件。(2)操作復雜操作時間長：需要提取核酸、PCR試劑配置、PCR反應、電泳、凝集成像、分析結果等，做一次病原檢測需要近一天時間。(3)結果相對不可靠：非常容易污染，即使是國內權威的實驗室檢測結果都存在假陽性結果。(4)環境要求高：很難在基層推廣，豬場配備了設備但是沒有人和時間使用。(5)每個實驗室獨立設計引物，檢測靈敏性不一致，質量控制不到位，標準不統一，難以標準化和數據分析。(6)病毒的組織嗜性不同采樣難度較大。目前常用血清學(ELISA)方法診斷偽狂犬病毒野毒株，但是血清學檢測方法是抗原和抗體反應，僅檢測1次無法準確判斷豬群的感染狀況和排毒狀況；血清學檢測抗體，檢測的抗體水平高低無法定量檢測分析，血清學僅能評價機體體液免疫產生的水平；血清學評估豬群健康度、對無癥狀帶毒和免疫耐受的豬群評估存在技術上的瓶頸；血清學需要采集前腔靜脈血，血樣采集相對費力、費時、且需要特殊設備輔助，多人協助。胎盤(Placenta)通常是指尿膜絨毛膜與子宮黏膜發生聯系所形成的結構，包括兩部分，即尿膜絨毛膜的絨毛部分為胎兒胎盤，子宮黏膜部分為母體胎盤。胎兒的血管和子宮血管各自分布到自己的胎盤部分上去，但并不直接相通。臍帶血通常是指胎兒娩出、臍帶結扎并離斷后殘留在胎盤和臍帶中的血液。在實際生產中，快速精準檢測臍帶血中的偽狂犬病毒野毒株難度相對很大，急需建立一種快速的臍帶血偽狂犬病毒野毒株的診斷方法，不僅可以對母豬疫苗株的安全評價及仔豬疾病的快速準確診斷，及時制定防控計劃，具有十分重要的臨床意義，而且可根據臍帶血檢測結果評估豬群PRV野毒感染狀況，開展偽狂犬疾病的凈化，達到規模化豬場偽狂犬野毒感染為陰性。因此，亟待建立一種可以精準診斷豬臍帶血偽狂犬病毒野毒株的方法。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提出一種診斷豬臍帶血偽狂犬病毒野毒株的Taqman實時熒光PCR試劑盒及其用途。該試劑盒具有靈敏度高、特異性好、重復性優、檢測結果快速客觀準確等優點，能同時反映母、仔豬豬偽狂犬病毒帶毒和排毒狀況，評估母豬豬偽狂犬疫苗的免疫效果，側面反映母豬的健康狀況水平，有益于對群體豬偽狂犬病毒感染的凈化和免疫情況的早期預警評判，進一步有助于豬場做好該疾病的預警、防控工作。基于上述目的，本專利技術提供的一種診斷豬臍帶血偽狂犬病毒野毒株的Taqman實時熒光PCR試劑盒，包括擴增引物和特異性熒光探針，所述擴增引物和特異性熒光探針的序列如下所示：上游擴增引物：5’-CTGGCTCTGCGTGCTGTGCTC-3’，其為SEQ ID NO:1序列；下游擴增引物：5’-CTCCTTCGTGATGACGTG-3’，其為SEQ ID NO:2序列；特異性熒光探針：FAM-5’-CTGGCTCTGCGTGCTGTGCTC-3’-TAMARA，其為SEQ ID NO:3序列，其中FAM為熒光報告基因，TAMARA為熒光淬滅基因。合理的引物設計和熒光探針設計是成功應用實時熒光PCR技術的關鍵。引物和探針的特異性對反應有很大影響，如果引物和探針特異性不高，可能在擴增構成中產生非靶標條帶，影響檢測結果的判定。利用本專利技術的引物和探針建立的實時熒光PCR方法能鑒別豬臍帶血中的偽狂犬病毒疫苗株和野毒株。采用實時熒光PCR方法鑒別豬臍帶血中的偽狂犬病毒疫苗株和野毒株，關鍵是需要針對兩者所存在的序列差異片段，設計得到特異性的引物和探針。PRV基因組全長約150kb，GC含量可以高達73％，至少含70多個基因，編碼約100種病毒蛋白。PRV gE基因是病毒增殖非必需基因。目前很多商業疫苗均缺失了PRV的gE基因，所以豬體內的PRV疫苗毒一般不存在gE基因，而PRV野毒有gE基因。偽狂犬病毒的gE基因中GC含量很高，高達74.4％，導致野毒株gE基因的擴增難度很大，且對酶和緩沖體系要求較高，設計檢測范圍更廣泛、特異性更強的引物和探針難度就更大。本專利技術引物和探針設計在PRV-gE基因上，參考NCBI已公布的212條偽狂犬gE基因設計引物和探針，該引物和探針的廣泛性和特異性強，用于擴增gE2基因，檢測結果能特異性區分PRV疫苗毒和PRV野毒。另外，結合豬胎盤的生理結構，豬屬于上皮絨毛胎盤，豬胎盤生理正常的結構即血胎屏障，胎盤屏障的存在使正常的臍帶血內不存在任何病原和抗體等大分子物質，即使母源抗體(如IgG，12nm)都不能通過此胎盤屏障，所以成熟的PRV粒子的直徑為150-180nm，就很難直接穿越胎盤屏障感染胎兒，也是一道天然的保護屏障。總之，采用從仔豬臍帶血中檢測PRV-gE基因來評價母豬偽狂犬野毒帶毒和排毒狀況，仔豬在母體內感染狀況和反饋母豬的健康狀況，是一種更加科學、直接和有效的診斷偽狂犬疾病、評估偽狂犬疫苗保護力水平和疾病預警方面的方法之一，在規模化豬場的偽狂犬疾病的凈化過程中起到更加可靠的技術支撐。在本專利技術中，優選的，所述上游擴增引物、所述下游擴增引物和所述特異性熒光探針的摩爾比為3:3:2。在本本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種診斷豬臍帶血偽狂犬病毒野毒株的Taqman實時熒光PCR試劑盒，其特征在于，包括擴增引物和特異性熒光探針，所述擴增引物和特異性熒光探針的序列如下所示：上游擴增引物：5’?CTGGCTCTGCGTGCTGTGCTC?3’，其為SEQ?ID?NO:1序列；下游擴增引物：5’?CTCCTTCGTGATGACGTG?3’，其為SEQ?ID?NO:2序列；特異性熒光探針：FAM?5’?CTGGCTCTGCGTGCTGTGCTC?3’?TAMARA，其為SEQ?ID?NO:3序列，其中FAM為熒光報告基因，TAMARA為熒光淬滅基因。

【技術特征摘要】
1.一種診斷豬臍帶血偽狂犬病毒野毒株的Taqman實時熒光PCR試劑盒，其特征在于，包括擴增引物和特異性熒光探針，所述擴增引物和特異性熒光探針的序列如下所示：上游擴增引物：5’-CTGGCTCTGCGTGCTGTGCTC-3’，其為SEQ ID NO:1序列；下游擴增引物：5’-CTCCTTCGTGATGACGTG-3’，其為SEQ ID NO:2序列；特異性熒光探針：FAM-5’-CTGGCTCTGCGTGCTGTGCTC-3’-TAMARA，其為SEQ ID NO:3序列，其中FAM為熒光報告基因，TAMARA為熒光淬滅基因。2.根據權利要求1所述的診斷豬臍帶血偽狂犬病毒野毒株的Taqman實時熒光PCR試劑盒，其特征在于，所述上游擴增引物、所述下游擴增引物和所述特異性熒光探針的摩爾比為3:3:2。3.根據權利要求2所述的診斷豬臍帶血偽狂犬病毒野毒株的Taqman實時熒光PCR試劑盒，其特征在于，所述上游擴增引物、所述下游擴增引物和所述特異性熒光探針在所述試劑盒中的終濃度均為0.1～5μM。4.根據權利要求1所述的診斷豬臍帶血偽狂犬病毒野毒株的Taqman實時熒光PCR試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括陰性對照、陽性對照、2×熒光定量Mixture。5.根據權利要求4所述的診斷豬臍帶血偽狂犬病毒野毒株的Taqman實時熒光PCR試劑盒，其特征在于，所述陰性對照為無DNA酶的ddH2O；所述陽性對照為含有豬偽狂犬病毒gE2基因序列的克隆質粒pEASY-T1-gE2，克隆質粒pEASY-T1-gE2的終濃度為1.0×105copies/μl～1.0×107copies/μl。6.根據權利要求5所述的診斷豬臍帶血偽狂犬病毒野毒株的Taqman實時熒光PCR試劑盒，其特征在于，所述豬偽狂犬病毒gE2基因的...

【專利技術屬性】
技術研發人員：喻正軍，李增強，廖娟紅，
申請(專利權)人：湖南新南方養殖服務有限公司，
類型：發明
國別省市：湖南;43