一種用于檢測沙門氏菌的增敏型核酸適配體試紙條制造技術

本實用新型專利技術公開了一種用于檢測沙門氏菌的增敏型核酸適配體試紙條，該試紙條由樣品墊、金標結合墊、包被膜和吸水膜依次粘貼組合到PVC底板上，其中，金標結合墊上涂覆有樹枝狀聚合物?金?適配體復合物增敏探針，包被膜上具有檢測線和質控線，抗沙門氏菌單克隆抗體，質控線上包被有鏈霉親和素。該試紙條利用端巰基的樹枝狀聚合物做為載體，大量偶聯(lián)膠體金，制備樹枝狀聚合物?金?適配體復合物增敏探針代替常規(guī)的金標適配體探針進行信號放大，可極大提高檢測靈敏度，且操作簡單、檢測速度快，無需專用儀器設備，成本低廉，非常適合于基層檢驗檢疫工作中大批量樣品中沙門氏菌的高靈敏快速檢測。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本技術涉及一種用于檢測沙門氏菌的增敏型核酸適配體試紙條，可以實現(xiàn)沙門氏菌的高靈敏快速檢測，屬于食品安全檢測領域。
技術介紹
沙門氏菌屬于革蘭氏陰性菌，是一種腸道桿菌致病菌，在自然界中廣泛存在，極易污染水源、肉類(尤其是禽類)、蛋類及蛋制品等，人或動物食用被污染的食品即會引發(fā)食物中毒。目前，在全世界范圍內，特別是發(fā)展中國家沙門氏菌感染事件逐年增多，我國70～80％的細菌性食物中毒是由沙門氏菌引起的，可見沙門氏菌污染已經嚴重威脅到人類健康和公共食品衛(wèi)生安全。因此，建立準確、靈敏、快速的沙門氏菌檢測技術對于保障食品安全和國民健康具有重要意義。目前沙門氏菌檢測方法主要有傳統(tǒng)的微生物檢驗技術、儀器分析法、分子生物學技術和免疫檢測方法等。其中，傳統(tǒng)的微生物檢測技術存在操作復雜，檢測時間長，靈敏度和特異性不高等缺點；儀器分析法簡單快速，但儀器設備價格昂貴，不適合現(xiàn)場快速檢測；分子生物學方法能縮短檢驗時間，靈敏度和特異性好，但費用昂貴，易污染，假陽性偏高；ELISA方法靈敏、快速、特異性好，已廣泛的應用于食品中微生物的檢測，但其結果解讀或者配套儀器較復雜，需要一定的專業(yè)知識。而金標層析試紙條正好可以避免這些弊端，不需要專用儀器，只需要插入、比對即可，具有快速、低成本，操作簡單易行，能滿足絕大部分食品樣品的檢測，非常適用于大量樣品的初篩。但是，常規(guī)的金標試紙條靈敏度較低，難以實現(xiàn)痕量目標物的快速分析。同時，隨著政府監(jiān)管體系的完善和檢測力度的加 強，食品中目標檢測物的濃度會越來越少，這對金標試紙條的靈敏度提出了更高的要求。
技術實現(xiàn)思路
本技術目的在于提供一種用于檢測沙門氏菌的增敏型核酸適配體試紙條，操作簡單，成本低廉，可實現(xiàn)食品中沙門氏菌的高靈敏快速檢測。本技術的技術方案如下：一種用于檢測沙門氏菌的增敏型核酸適配體試紙條，包括PVC底板，在PVC底板上依次設置有樣品墊，金標結合墊，硝酸纖維素膜和吸水墊四種粘貼物；所述相鄰粘貼物之間相互連接疊放；所述硝酸纖維素膜上依次設置有檢測線和質控線。所述金標結合墊上包被有樹枝狀聚合物-金粒子-核酸適配體納米復合物；所述樹枝狀聚合物為端巰基的樹枝狀聚合物；所述核酸適配體的DNA序列的5’端被巰基標記，3’端被生物素標記。所述檢測線上包被抗沙門氏菌單克隆抗體。所述質控線上包被有鏈霉親和素。所述用于檢測沙門氏菌的增敏型核酸適配體試紙條的制備方法，其具體制備步驟如下：(1)樹枝狀聚合物-金納米粒子復合物的制備稱取0.1-0.4mg的樹枝狀聚合物溶解到5mL丙酮中，取新合成的粒徑為10-20nm的膠體金溶液1mL膠體金溶液分散到5mL純水中，在氮氣保護和快速攪拌下，將膠體金溶液逐滴滴加到樹枝狀聚合物溶液中，磁力攪拌下室溫反應12h后，10000rpm 4℃離心30min，棄上清，用純水洗滌沉淀物，離心洗滌并重復3次后將沉淀用重懸液(20mM Na3PO4，5％BSA，0.25％Tween-20，10％蔗糖)重懸，得到10倍濃縮的樹枝狀聚合物-金納米粒子復合物溶液。(2)樹枝狀聚合物-金粒子-核酸適配體復合物的制備取10 uL 1uM的核酸適配體加入到2uL醋酸緩沖液(0.5M，pH5.0)和3uL 1mM三羧甲基磷酸溶液中，室溫避光放置1h，得到活化的核酸適配體溶液。取10倍濃縮的樹枝狀聚合物-金納米粒子復合物溶液200uL，逐滴加入到活化的核酸適配體溶液中，室溫下攪拌60min；取170uL 100uM的dATP加入到上述反應液中，室溫下繼續(xù)攪拌30min；逐步將0.1M的NaCl溶液加入到反應液中，使NaCl的終濃度達到30mM，室溫下反應1h后放置與4℃冰箱過夜孵育；9400g離心10min后沉淀用重懸液重懸至200uL，得到樹枝狀聚合物-金粒子-核酸適配體復合物。沙門氏菌核酸適配體序列為：5’-SH-TAT GGC GGC GTC ACC CGA CGG GGA CTT GAC ATT ATG ACA G-biotin-3’，由生工生物工程(上海)有限公司合成。(3)樹枝狀聚合物-金粒子-核酸適配體增敏探針金標結合墊的制備用三維平面點膜噴金儀將上述制備的樹枝狀聚合物-金粒子-核酸適配體復合物均勻的噴涂到玻璃纖維膜上，噴液量為0.7uL/cm，置于37℃烘干后封裝備用。(4)具有檢測線和質控線的包被膜的制備用三維平面點膜噴金儀將濃度為0.5-1mg/mL的抗沙門氏菌單克隆抗體溶液均勻的噴涂到硝酸纖維素膜上，得到檢測線(T線)；將濃度為0.5-2mg/mL的鏈霉親和素溶液均勻的噴涂到硝酸纖維素膜上，得到質控線(C線)。(5)增敏型沙門氏菌核酸適配體層析試紙條的制備將樣品膜、樹枝狀聚合物-金粒子-核酸適配體增敏探針金標結合墊、具有檢測線和質控線的硝酸纖維素膜和吸水墊依次粘貼組合到PVC底板上，相鄰粘貼物之間的重疊部分長度為2mm，用切割機切成3mm寬的試紙條，得到基于增敏探針的增敏型沙門氏菌適配體試紙條，與干燥劑一起裝于鋁箔袋中密封保存?zhèn)溆谩１炯夹g試紙條的工作原理：以樹枝狀聚合物做為載體，利用其外圍大量的巰基，通過金硫鍵自組裝可偶聯(lián)大量金納米粒子。當待測樣品中存在沙門 氏菌時，沙門氏菌先和金標結合墊上的樹枝狀聚合物-金粒子-核酸適配體復合物特異結合，隨著毛細管作用繼續(xù)層析到硝酸纖維素膜上，再與檢測線上包被的抗沙門氏菌的抗體發(fā)生免疫識別反應，在檢測線上顯現(xiàn)出一定顏色的沉淀線；多余的樹枝狀聚合物-金粒子-核酸適配體復合物繼續(xù)向前，核酸適配體上標記的生物素和質控線上包被的鏈霉親和素發(fā)生結合，金納米粒子富集使得質控線顯色；如果待測樣品中不存在沙門氏菌時，樹枝狀聚合物-金粒子-核酸適配體復合物在檢測線上不產生富集，繼續(xù)層析遷移和質控線上的鏈霉親和素發(fā)生結合，試紙條檢測線不顯色，而質控線顯色。試紙條的檢測線和質控線均是由金納米粒子聚集而顯色，與常規(guī)試紙條相比，當沙門氏菌濃度極低時，檢測線上也可富集更多的金納米粒子，其沉淀線顯色也會更深，因此，可實現(xiàn)比常規(guī)試紙條更低濃度目標物的超靈敏檢測，顯著提高試紙條檢測方法的靈敏度。本技術的有益效果：本技術針對現(xiàn)有金標試紙條靈敏度低難以滿足沙門氏菌高靈敏檢測的實際難題，提供一種用于檢測沙門氏菌的增敏型核酸適配體試紙條，借助于樹枝狀聚合物的端巰基來偶聯(lián)大量的金納米粒子，進一步與特異性識別沙門氏菌的核酸適配體組裝制備樹枝狀聚合物-金-核酸探針，并做為信號增敏探針代替常規(guī)的金-核酸適配體探針，能夠顯著提高傳統(tǒng)試紙條檢測方法的靈敏度，實現(xiàn)對沙門氏菌的高靈敏檢測，同時具有操作簡單、快速、結果容易判讀，成本低等特點，非常適合于基層檢驗檢疫工作中大批量樣品中沙門氏菌的快速初篩。附圖說明圖1本技術試紙條的組成結構示意圖。圖2本技術試紙條的檢測原理示意圖。圖3本技術試紙條的檢測結果判定圖。附圖中序號說明：1：PVC底板；2：樣品墊；3：增敏探針金標結合墊；4：硝酸纖維素膜；5：吸水墊；6：檢測線；7：質控線。具體實施方式實施例1如圖1所示，一種用于檢測沙門氏菌的增敏型核酸適配體試紙條，其中序號1為PVC底板，其兩端分別設有樣品墊2和吸水墊5；在PVC底板的中部設置有硝酸纖維素膜檢測層4，其上有檢測線6和質控線7；在硝酸纖維素膜本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于檢測沙門氏菌的增敏型核酸適配體試紙條，包括PVC底板(1)，在所述PVC底板(1)上依次粘貼有樣品膜(2)，增敏探針金標結合墊(3)，硝酸纖維素膜(4)和吸水膜(5)四種粘貼物；所述相鄰粘貼物之間相互連接疊放；所述硝酸纖維素膜(4)上依次設置有檢測線(6)和質控線(7)。

【技術特征摘要】
1.一種用于檢測沙門氏菌的增敏型核酸適配體試紙條，包括PVC底板(1)，在所述PVC底板(1)上依次粘貼有樣品膜(2)，增敏探針金標結合墊(3)，硝酸纖維素膜(4)和吸水膜(5)四種粘貼物；所述相鄰粘貼物之間相互連接疊放；所述硝酸纖維素膜(4)上依次設置有檢測線(6)和質控線(7)。2.根據(jù)權利要求1所述用于檢測沙門氏菌的增敏型核酸適配體試紙條，其特征在于：所述金...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：孫鳳霞，康立超，彭夏雨，楊井泉，李紅敏，黨富民，雷用東，向曉黎，王靜，王東健，
申請(專利權)人：新疆農墾科學院，孫鳳霞，
類型：新型
國別省市：新疆;65