本發(fā)明專利技術(shù)涉及結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白Rv1798及其T細胞表位肽在制備結(jié)核檢測試劑、疫苗和藥物中的應(yīng)用，所述抗原蛋白Rv1798及其T細胞表位肽氨基酸序列分別如SEQ?ID?NO:1?3所示。本發(fā)明專利技術(shù)利用結(jié)核分枝桿菌Rv1798蛋白抗原及其T細胞表位肽作為刺激物用于結(jié)核分枝桿菌引起的特異性T細胞和B細胞免疫反應(yīng)，本發(fā)明專利技術(shù)利用結(jié)核分枝桿菌Rv1798蛋白抗原及其表位肽作為刺激物用于結(jié)核分枝桿菌感染引起的特異性T細胞和B細胞免疫反應(yīng)，與以往采用完全抗原相比，能夠降低由于抗原不純造成的假陽性。由所述Rv1798蛋白抗原及其表位肽制備的檢測試劑可廣泛用于結(jié)核病的輔助診斷、流行病學(xué)監(jiān)測等相關(guān)領(lǐng)域。Rv1798蛋白抗原及其表位肽制備的結(jié)核疫苗和抗結(jié)核藥物可用于結(jié)核病的預(yù)防和治療。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及分子生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白Rv1798及其T細胞表位肽在結(jié)核病檢測試劑、疫苗和藥物制備中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性傳染性疾病，調(diào)查結(jié)果顯示全世界有三分之一的人口處于潛伏感染，且有5％～10％在未來的生活中將可能發(fā)展為活動性結(jié)核病。自1993年世界衛(wèi)生組織宣布結(jié)核病成為全球危機后，結(jié)核病的發(fā)病率和死亡率一直居高不下，據(jù)WHO報告，每年新增結(jié)核病人約800萬，每年約有200～300萬人死于結(jié)核病。我國在22個結(jié)核高負擔(dān)國家中位居第2位，全國第5次流行病學(xué)抽樣檢查結(jié)果顯示：全國130萬人發(fā)病，占全球發(fā)病率的14.3％，我國也是全球27個耐藥結(jié)核病高負擔(dān)國家之一，耐多藥結(jié)核病患病人數(shù)占據(jù)全球第一。每個未經(jīng)治療的活動性肺結(jié)核病人能夠傳染10～15人。結(jié)核病已經(jīng)成為全球重要的衛(wèi)生問題，需引起人們的高度重視。結(jié)核的早期診斷和預(yù)防治療對結(jié)核病的控制至關(guān)重要，臨床上常用的是細菌學(xué)方法痰涂片鏡檢和痰培養(yǎng)，痰涂片鏡檢是世界范圍內(nèi)結(jié)核病檢查中使用最廣泛的技術(shù)，由于此法設(shè)備簡便，適合在經(jīng)濟不發(fā)達的地區(qū)使用。但是由于對樣本中的菌含量要求高，因此該方法靈敏度不高，導(dǎo)致大量涂陰患者不被發(fā)現(xiàn)從而轉(zhuǎn)陽，且涂陰患者具有傳染性，不容忽視，該方法無種特異性，靈敏度差，受痰液標(biāo)本和病情的影響。痰培養(yǎng)作為結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是存在培養(yǎng)時間過長，現(xiàn)在已有BACTEC MGIT960系統(tǒng)等快速培養(yǎng)系統(tǒng)可在2周內(nèi)分離培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌，但由于其配制的培養(yǎng)基、營養(yǎng)添加劑、雜菌抑制劑價格昂貴，無法在發(fā)展中國家廣泛推廣，并且快速培養(yǎng)與改良L-J培養(yǎng)相比污染率顯著增高，導(dǎo)致假陽性結(jié)果出現(xiàn)。常用的用于人群篩查的檢測方法是皮膚結(jié)核菌素實驗，使用的是結(jié)核菌純蛋白衍生物(PPD)，由于PPD中含有許多分枝桿菌種類(致病性分枝桿菌、環(huán)境分枝桿菌和BCG)所共有的抗原分子，因此PPD診斷結(jié)核病的特異性較差，不能有效區(qū)分結(jié)核分枝桿菌感染與卡介苗接種，結(jié)核的影像學(xué)檢查如常規(guī)的X線檢查、CT檢查、MRI檢查、超聲檢查等價格昂貴，且對身體造成一定傷害，特異性低，不適合用于常規(guī)的檢查診斷。結(jié)核分枝桿菌侵入人體后寄居在巨噬細胞內(nèi)，人體對結(jié)核分枝桿菌主要的免疫反應(yīng)是細胞免疫應(yīng)答，主要參與的細胞是CD4+和CD8+T細胞。CD8+T細胞可以通過穿孔素、顆粒酶等途徑將被結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細胞或樹突狀細胞殺死從而達到清除結(jié)核分枝桿菌的目的。感染結(jié)核分枝桿菌的人再次接觸結(jié)核分枝桿菌特異性抗原時，T淋巴細胞增殖產(chǎn)生IFN-γ，通過單克隆抗體檢測出IFN-γ即可確定曾經(jīng)或正在感染結(jié)核分枝桿菌。目前以T細胞為基礎(chǔ)的檢測方法T-SPOT是利用IFN-γ特異性抗體捕獲經(jīng)結(jié)核抗原刺激的外周血淋巴細胞培養(yǎng)后產(chǎn)生的IFN-γ，并以酶聯(lián)免疫斑點顯色的方式表現(xiàn)出來，從斑點的數(shù)量來確定細胞分泌細胞因子的情況，從單細胞水平評價細胞免疫功能。以T細胞為基礎(chǔ)的體外γ干擾素的檢測被用于結(jié)核病的輔助診斷，該檢測方法不僅能篩選出活動性結(jié)核病人，同時也能檢測出潛伏期病人，從而能更好的預(yù)防和控制潛伏期結(jié)核，目前已有以結(jié)核分枝桿菌基因組RD1區(qū)編碼的結(jié)核特異性抗原ESAT-6和CFP-10的全蛋白或多肽為刺激物的商品化的IGRA檢測試劑盒，如QuantiFERON-TB Gold test和T-SPOT，均呈現(xiàn)較高的靈敏性和特異性。Rv1798(GI:15608935)是結(jié)核分枝桿菌H37Rv ESX分泌系統(tǒng)中的保守膜蛋白，含610個氨基酸，其編碼基因全長1833bp，能夠在細胞上清中檢測出來，利用生物信息學(xué)軟件對其進行抗原表位預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)Rv1798蛋白存在較多的T細胞表位，具有潛在的診斷效能。本專利技術(shù)建立在反向疫苗學(xué)的基礎(chǔ)上，利用計算機篩選出結(jié)核分枝桿菌可能的免疫原性抗原庫，然后利用生物信息學(xué)軟件TE predict和IEDB預(yù)測結(jié)核抗原MHC-I類T細胞表位，通過固態(tài)合成法合成這些多肽，先利用人群免疫篩選試驗對結(jié)核新抗原進行篩選，篩選出免疫優(yōu)勢抗原可一方面用于結(jié)核診斷，另一方面可用于卡介苗的改造。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白Rv1798的應(yīng)用。本專利技術(shù)的另一目的是提供結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白Rv1798T細胞表位肽及其應(yīng)用。本專利技術(shù)基于以下構(gòu)思：Rv1798是結(jié)核分枝桿菌上的保守膜蛋白，是可在H37Rv培養(yǎng)上清中檢測出來的分泌蛋白。本專利技術(shù)基于T細胞IFN-γ釋放技術(shù)，利用生物信息學(xué)軟件TE predict和IEDB對Rv1798編碼基因上T細胞抗原表位進行預(yù)測，利用固態(tài)合成法合成表位多肽，再通過T-SPOT對結(jié)核病人、肺部其他疾病患者、健康人體內(nèi)的特異性T淋巴細胞進行檢測，從而評價該抗原用于結(jié)核檢測的靈敏度和特異性。為了實現(xiàn)本專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)提供結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白Rv1798在制備結(jié)核檢測與診斷試劑中的應(yīng)用；其中，所述抗原蛋白Rv1798的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有相同免疫原性和相同抗原性的氨基酸序列。本專利技術(shù)還提供結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白Rv1798T細胞表位肽，所述表位肽選自P308和P309，其氨基酸序列分別如SEQ ID NO:1-2所示。本專利技術(shù)還提供由所述T細胞表位肽衍生的表位肽或其類似物。本專利技術(shù)還提供編碼所述表位肽的DNA分子。本專利技術(shù)還提供含有編碼所述表位肽的DNA分子的表達盒及表達載體。本專利技術(shù)還提供含有編碼所述表位肽的DNA分子的轉(zhuǎn)基因細胞系。本專利技術(shù)還提供含有編碼所述表位肽的DNA分子的重組菌及其表達純化的重組蛋白。本專利技術(shù)還提供所述表位肽、編碼所述表位肽的DNA分子、所述轉(zhuǎn)基因細胞系或所述重組菌及其表達純化的重組蛋白在制備結(jié)核檢測試劑、疫苗和藥物中的應(yīng)用。本專利技術(shù)還提供一種結(jié)核診斷試劑，所述診斷試劑中含有結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白Rv1798，或編碼所述抗原蛋白Rv1798的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重組菌產(chǎn)生的重組蛋白；和/或，所述表位肽、編碼所述表位肽的DNA分子和/或所述重組蛋白。本專利技術(shù)還提供含有上述診斷試劑的結(jié)核T-SPOT檢測試劑盒。所述試劑盒還包括以下材料或試劑：①一抗：抗人或動物IFN-γ的小鼠IgG單克隆抗體。②酶標(biāo)試劑：辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人或動物IFN-γ不同表位的另一種小鼠IgG單克隆抗體。③標(biāo)準(zhǔn)品：培養(yǎng)板：含有PVDF膜或硝酸纖維素膜的96孔微孔反應(yīng)板，陽性對照孔中含有結(jié)核非特異性刺激抗原(如PHA等)，陰性對照孔含有PBS或基底液。④其他T-SPOT檢測所需的試劑及耗材。優(yōu)選地，一抗固定在上述微孔反應(yīng)板上。本專利技術(shù)是基于雙抗體夾心原理，采用T-SPOT法檢測抗原，實驗過程為：PVDF膜上包被的一抗作為捕獲抗體能夠結(jié)合細胞上清中的IFN-γ，而IFN-γ又能被酶標(biāo)二抗捕獲、顯色。兩種抗體為識別IFN-γ不同抗原表位的單克隆抗體。本專利技術(shù)還提供結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白Rv1798和/或所述表位肽、編碼所述表位肽的DNA分子、所述轉(zhuǎn)基因細胞系或所述重組菌及其表達純化的重組蛋白在制備結(jié)核疫苗和抗結(jié)核藥物中的應(yīng)用。本專利技術(shù)還提供一種結(jié)核疫苗，其有效成分為結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白Rv1798，或編碼所述抗原蛋白Rv1798的DNA分子，或由含本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白Rv1798在制備結(jié)核檢測與診斷試劑中的應(yīng)用；其中，所述抗原蛋白Rv1798的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:3所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有相同免疫原性和相同抗原性的氨基酸序列。
【技術(shù)特征摘要】
1.結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白Rv1798在制備結(jié)核檢測與診斷試劑中的應(yīng)用；其中，所述抗原蛋白Rv1798的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有相同免疫原性和相同抗原性的氨基酸序列。2.結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白Rv1798T細胞表位肽，其特征在于，所述表位肽選自如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列。3.權(quán)利要求2所述表位肽在制備結(jié)核檢測試劑、疫苗和藥物中的應(yīng)用。4.一種結(jié)核診斷試劑，其特征在于，所述診斷試劑中含有結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白Rv1798，或編碼所述抗原蛋白Rv1798的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重組菌產(chǎn)生的重組蛋白；和/或，權(quán)利要求2所述表位肽，或編碼所述表位肽的DNA分子，或由含有編碼所述表位肽的DNA分子的重組菌產(chǎn)生的重組蛋白。5.含有權(quán)利要求4所述診斷試劑的結(jié)核T-SPOT檢測試劑盒。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中含有：①一抗：抗人或動物IFN-γ的小鼠IgG單克隆抗體；②酶標(biāo)試劑：辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人或動物IFN-γ不同表位的另一種小鼠IgG單克隆抗體；③標(biāo)準(zhǔn)品：培養(yǎng)板：含有PVDF膜或...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：萬康林，王雪枝，鄭華軍，蔣毅，劉海燦，
申請(專利權(quán))人：中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，上海人類基因組研究中心，
類型：發(fā)明
國別省市：北京;11
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