一種豇豆花葉病毒亞科病毒廣譜檢測試劑盒及其方法技術

本發明專利技術公開了一種豇豆花葉病毒亞科病毒廣譜檢測試劑盒及其檢測方法。本發明專利技術所提供的豇豆花葉病毒亞科病毒廣譜檢測試劑盒中含有由三條引物組成的成套引物。實驗證明，本發明專利技術所提供的用于檢測豇豆花葉病毒亞科病毒的成套引物及其試劑盒具有廣譜性好、靈敏度高、特異性強、檢測周期短等特點，適用于農業生產及進出境口岸上豇豆花葉病毒亞科病毒的快速檢測與監測。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于植物檢疫
，涉及一種豇豆花葉病毒亞科病毒廣譜檢測試劑盒及其檢測方法，特別涉及用于豇豆花葉病毒亞科病毒的成套引物、試劑盒及其檢測方法。
技術介紹
豇豆花葉病毒亞科(Comovirinae)屬于小RNA病毒目(Picornavirales)、伴生豇豆病毒科(Secoviridae)，含有豇豆花葉病毒屬(Comovirus)、蠶豆病毒屬(Fabavirus)和線蟲傳多面體病毒屬(Nepovirus)，分別含有15種、5種和36種病毒。在豇豆花葉病毒屬病毒中，有11種病毒的寄主范圍比較窄，僅侵染豆科植物，而其他種類則侵染茄科、十字花科、葫蘆科等植物。豇豆花葉病毒屬病毒主要引起花葉、斑駁癥狀，通常不會引起環斑癥狀。蠶豆病毒屬病毒具有非常廣的寄主范圍，包括雙子葉植物，以及一些科的單子葉植物。蠶豆病毒屬病毒引起的癥狀包括環斑、斑駁、花葉、畸型、萎蔫和頂端壞死。線蟲傳多面體病毒屬病毒的寄主因病毒而異，有寬有窄，廣泛分布于溫帶地區。環斑是線蟲傳多面體病毒屬病毒侵染的典型癥狀，但通常伴隨斑駁和斑點癥狀。豇豆花葉病毒屬病毒只通過甲蟲傳播，特別是葉甲科的種類。蠶豆病毒屬病毒則通過蚜蟲傳播。線蟲傳多面體病毒屬中的12種病毒通過長針線蟲傳播，3種通過花粉傳播，1種通過螨蟲傳播，而其它病毒種類的傳播介體還未知。該亞科病毒中，近一半的病毒種類還可以通過種子傳播。豇豆花葉病毒亞科中的多種病毒成員具有十分重要的經濟重要性，對農業生產安全和生態安全造成巨大的威脅。該亞科病毒中，有8種病毒被我國列為禁止進境的檢疫性有害生物，包括：南芥菜花葉病毒(Arabis mosaic virus,ArMV)、菜豆莢斑駁病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)、蠶豆染色病毒(Broad bean stain virus,BBSV)、豇豆重花葉病毒(Cowpea severe mosaic virus,CPSMV)、桃叢簇花葉病毒(Peach rosette mosaic virus,PRMV)、煙草環斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)、番茄環斑病毒(Tomato black ring virus,TBRV)、番茄黑斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)。此外，還有一半還多的病毒種類在我國尚未報道發生。目前，在豇豆花葉病毒亞科病毒日常檢測中，快速的檢測方法普遍使用血清學和分子生物學方法，特別是酶聯免疫吸附試驗(ELISA)方法和反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)方法。其中，ELISA檢測需要特異的抗體，通常都是由專業的試劑公司提供。目前，國內外檢測試劑公司提供的豇豆花葉病毒亞科病毒檢測抗體種類還十分有限，只局限于其中幾種病毒。RT-PCR方法是豇豆花葉病毒亞科病毒檢測中使用非常廣泛的另外一種快速檢測方法。目前，國內外只是建立其中幾種密切關注的病毒種類，有些病毒種類甚至還未知其基因組序列。因此，在豇豆花葉病毒亞科病毒中，多數的病毒種類沒有相應的血清學，也沒有快速的分子檢測方法。
技術實現思路
本專利技術的第一個目的是提供一種檢測或輔助檢測豇豆花葉病毒亞科病毒的成套引物。本專利技術提供的檢測或輔助檢測豇豆花葉病毒亞科病毒的成套引物為如下1)或2)：1)由引物1、引物2和引物3組成；2)由引物1、引物2、引物4和引物5組成；所述引物1為序列1所示的單鏈DNA分子；所述引物2為序列2所示的單鏈DNA分子；所述引物3為序列3所示的單鏈DNA分子；所述引物4為序列4所示的單鏈DNA分子；所述引物5為序列5所示的單鏈DNA分子。本專利技術的第二個目的是提供一種檢測或輔助檢測豇豆花葉病毒亞科病毒的PCR試劑。本專利技術提供的檢測或輔助檢測豇豆花葉病毒亞科病毒的PCR試劑包括上述成套引物。上述PCR試劑中，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4和所述引物5在所述PCR試劑中的終濃度均為10μmol/L。本專利技術所提供的檢測或輔助檢測豇豆花葉病毒亞科病毒的PCR試劑，具體可包括所述成套引物，以及M-MLV反轉錄酶、5×M-MLV緩沖液、dNTPs、RNA酶抑制劑、10×Taq DNA聚合酶緩沖液(含Mg2+)和Taq DNA聚合酶。本專利技術的第三個目的是提供一種檢測或輔助檢測豇豆花葉病毒亞科病毒的試劑盒。本專利技術提供的檢測或輔助檢測豇豆花葉病毒亞科病毒的試劑盒包括上述成套引物或上述PCR試劑。本專利技術所提供的檢測或輔助檢測豇豆花葉病毒亞科病毒的試劑盒，具體可含有所述成套引物或所述PCR試劑，以及作為陽性對照的豇豆花葉病毒亞科病毒的病葉凍干粉末(如含有豇豆花葉病毒的葉片凍干粉末)；和/或作為陰性對照的水。本專利技術的第四個目的是提供上述成套引物或上述PCR試劑或上述試劑盒的新用途。本專利技術提供了上述成套引物或上述PCR試劑或上述試劑盒在檢測或輔助檢測待測病毒是否為豇豆花葉病毒亞科病毒中的應用。本專利技術還提供了上述成套引物或上述PCR試劑或上述試劑盒在制備檢測或輔助檢測待測病毒是否為豇豆花葉病毒亞科病毒的產品中的應用。本專利技術還提供了上述成套引物或上述PCR試劑或上述試劑盒在檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有豇豆花葉病毒亞科病毒中的應用。本專利技術還提供了上述成套引物或上述PCR試劑或上述試劑盒在制備檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有豇豆花葉病毒亞科病毒的產品中的應用。本專利技術的五個目的是提供一種檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有豇豆花葉病毒亞科病毒的方法。本專利技術提供的檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有豇豆花葉病毒亞科病毒的方法包括如下步驟：(1)從所述待測樣品中提取總RNA，采用上述引物1進行反轉錄反應，得到待測cDNA；(2)以所述待測cDNA作為模板，采用上述引物1和上述引物2進行第一輪PCR反應，獲得第一輪PCR產物；(3)以第一輪PCR產物作為模板，采用上述引物1和上述引物3進行第二輪PCR反應，獲得第二輪PCR產物；或以第一輪PCR產物作為模板，采用上述引物4和上述引物5進行第二輪PCR反應，獲得第二輪PCR產物；(4)根據所述第二輪PCR產物的大小按照如下方法確定所述待測樣品中是否含有豇豆花葉病毒亞科病毒：若所述第二輪PCR產物中含有大小為400～440bp的DNA片段，則所述待測樣品中含有或候選含有豇豆花葉病毒亞科病毒，反之則所述待測樣品中不含有或候選不含有豇豆花葉病毒亞科病毒。上述方法中，所述反轉錄反應的溫度為42℃。上述方法中，所述第一輪PCR反應共進行35個循環，前5個循環的退火溫度為42℃，后30個循環的退火溫度為50℃。上述方法中，所述第二輪PCR反應共進行40個循環，前5個循環的退火溫度為42℃，后35個循環的的退火溫度為52℃。在本專利技術中，以上所有的所述待測樣品均可為植物樣品，如感染了豇豆花葉病毒亞科病毒的植物葉片。在本專利技術中，以上所有的所述豇豆花葉病毒亞科病毒均可為如下中的任一種或多種：愛琴海菊芋環斑病毒、安弟斯馬鈴薯斑駁病毒、安那托利亞葡萄環斑病毒、澳洲紫花苜蓿潛隱病毒、保加利亞葡萄潛隱病毒、菜豆粗縮花葉病毒、菜豆莢斑駁病毒、蠶豆染色病毒、蠶豆萎蔫病毒1號、蠶豆萎蔫病毒2號、蠶豆真花葉病毒、鶉豌豆花葉病毒、大豆屬花葉病毒、滇芎A病毒、番茄黑環病毒、番茄環斑病毒、廣藿香輕型花葉病本文檔來自技高網...

【技術保護點】
檢測或輔助檢測豇豆花葉病毒亞科病毒的成套引物，為如下1)或2)：1)由引物1、引物2和引物3組成；2)由引物1、引物2、引物4和引物5組成；所述引物1為序列1所示的單鏈DNA分子；所述引物2為序列2所示的單鏈DNA分子；所述引物3為序列3所示的單鏈DNA分子；所述引物4為序列4所示的單鏈DNA分子；所述引物5為序列5所示的單鏈DNA分子。

【技術特征摘要】
1.檢測或輔助檢測豇豆花葉病毒亞科病毒的成套引物，為如下1)或2)：1)由引物1、引物2和引物3組成；2)由引物1、引物2、引物4和引物5組成；所述引物1為序列1所示的單鏈DNA分子；所述引物2為序列2所示的單鏈DNA分子；所述引物3為序列3所示的單鏈DNA分子；所述引物4為序列4所示的單鏈DNA分子；所述引物5為序列5所示的單鏈DNA分子。2.一種檢測或輔助檢測豇豆花葉病毒亞科病毒的PCR試劑，包括權利要求1所述的成套引物。3.根據權利要求2所述的PCR試劑，其特征在于：所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4和所述引物5在所述PCR試劑中的終濃度均為10μmol/L。4.一種檢測或輔助檢測豇豆花葉病毒亞科病毒的試劑盒，包括權利要求1所述的成套引物或權利要求2或3所述的PCR試劑。5.權利要求1所述的成套引物或權利要求2或3所述的PCR試劑或權利要求4所述的試劑盒在檢測或輔助檢測待測病毒是否為豇豆花葉病毒亞科病毒中的應用；或權利要求1所述的成套引物或權利要求2或3所述的PCR試劑或權利要求4所述的試劑盒在制備檢測或輔助檢測待測病毒是否為豇豆花葉病毒亞科病毒的產品中的應用。6.權利要求1所述的成套引物或權利要求2或3所述的PCR試劑或權利要求4所述的試劑盒在檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有豇豆花葉病毒亞科病毒中的應用；或權利要求1所述的成套引物或權利要求2或3所述的PCR試劑或權利要求4所述的試劑...

【專利技術屬性】
技術研發人員：廖富榮，沈建國，黃蓬英，方志鵬，林振基，
申請(專利權)人：廈門出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，
類型：發明
國別省市：福建;35