一種對黃曲霉休眠孢子轉(zhuǎn)化外源DNA的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種對黃曲霉休眠孢子轉(zhuǎn)化外源DNA的方法，包括黃曲霉培養(yǎng)和孢子收集、黃曲霉孢子預(yù)處理以及使用HDEN法電擊黃曲霉孢子三個步驟，得到導(dǎo)入待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的黃曲霉孢子。本發(fā)明專利技術(shù)用未萌發(fā)的孢子來作為導(dǎo)入外源分子的起始材料，并且應(yīng)用HDEN電轉(zhuǎn)化技術(shù)將外源DNA導(dǎo)入黃曲霉休眠孢子，可以省去做孢子萌發(fā)這一復(fù)雜的步驟，省去傳統(tǒng)方法中制備原生質(zhì)體或農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的步驟等，并且轉(zhuǎn)化率高，每個轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系，至少可以達(dá)到不少于6000個陽性轉(zhuǎn)化子的效果。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于生物
，具體涉及一種對黃曲霉休眠孢子轉(zhuǎn)化外源DNA的方法。
技術(shù)介紹
黃曲霉，半知菌類，一種常見腐生真菌。多見于發(fā)霉的糧食、糧制品及其它霉腐的有機(jī)物上。它可用于產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶和磷酸二酯酶等，也是釀造工業(yè)中的常見菌種。對其進(jìn)行基因改造，需要轉(zhuǎn)化外源DNA進(jìn)入細(xì)胞。但是對黃曲霉轉(zhuǎn)化外源DNA非常困難。基因工程是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，將不同來源的基因按預(yù)先設(shè)計的藍(lán)圖，在體外構(gòu)建DNA分子，然后導(dǎo)入細(xì)胞，以改變生物原有的遺傳特性，獲得新品種，生產(chǎn)新產(chǎn)品（比如將某個具有重要經(jīng)濟(jì)價值的酶基因，導(dǎo)入到黃曲霉細(xì)胞內(nèi)，做酶蛋白高表達(dá)，生產(chǎn)該酶）。這一領(lǐng)域中，很重要的一個環(huán)節(jié)，就是把外來的DNA，導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)部。針對不同物種和不同狀態(tài)的細(xì)胞，需要不同的導(dǎo)入方法，才可以讓外來的DNA跨過細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)部。目前用于絲狀真菌領(lǐng)域（包括黃曲霉）的主要DNA轉(zhuǎn)化方法包括：1．原生質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化（protoplast-mediated transformation）：該方法使用各種酶水解真菌菌絲體的細(xì)胞壁，暴露出細(xì)胞膜，在一定的化學(xué)條件下，細(xì)胞膜可以吸收外源DNA。但是由于真菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和成分復(fù)雜，而且不同物種、甚至同一物種的不同亞種的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分都不一樣，因此，無法統(tǒng)一原生質(zhì)體制備的方法，而且，很多真菌，尤其是黃曲霉，原生質(zhì)體制備非常困難，步驟極其繁瑣，而且需要特殊的、昂貴的細(xì)胞壁水解酶。2.根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation）：根瘤農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）是一種革蘭氏陰性菌，能夠侵染植物愈傷組織和絲狀真菌，將能在細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳的環(huán)狀質(zhì)粒Ti-DNA插入到宿主的基因組中。但是該方法步驟很繁瑣，耗時長，而且農(nóng)桿菌對宿主有選擇性，并非所有真菌都適合用這種方法。此外，外源DNA插入宿主基因組的位置是隨機(jī)的，無法預(yù)判。外源DNA只能插入宿主基因組，不能夠游離地存活在宿主的細(xì)胞質(zhì)中。3．基因槍轉(zhuǎn)化法（Biolistic Transformation）：該方法將DNA吸附在特種金屬顆粒的表面，用火藥爆炸或者高壓氣體加速，將吸附了DNA的金屬顆粒直接送入完整的組織或者細(xì)胞。這種方法需要非常昂貴的特殊實驗設(shè)備，而且所用的金屬顆粒耗材常常需要使用黃金材料。此外，該方法轉(zhuǎn)化效率并不高，而且宿主細(xì)胞在金屬顆粒轟擊下死亡率高，再生較困難，因此其使用范圍受到限制。4，電擊轉(zhuǎn)化（Electroporation）：這是一種用電脈沖短暫作用于接觸了外源DNA的細(xì)胞，使外源DNA進(jìn)入細(xì)胞，從而使細(xì)胞遺傳特性發(fā)生改變的方法。與農(nóng)桿菌法需要農(nóng)桿菌作為介質(zhì)、基因槍法需要金屬顆粒作為介質(zhì)不同，這種方法不需要介質(zhì)來攜帶外源DNA。傳統(tǒng)的電擊法，包括指數(shù)衰減波電擊和方波電擊。指數(shù)衰減波電擊的能量特別大，對細(xì)胞的損傷也很大，而微生物細(xì)胞由于結(jié)構(gòu)簡單，有細(xì)胞壁，細(xì)胞抗逆性強(qiáng)，生命力強(qiáng)，而且很多微生物細(xì)胞的外殼堅硬，能夠耐受大能量電擊，因此指數(shù)衰減波電擊一般僅用于微生物細(xì)胞。而哺乳動物細(xì)胞（比如人類細(xì)胞系），相對微生物而言，比較脆弱，容易死亡，因此，方波電擊常用于哺乳動物細(xì)胞。此外，方波電擊還廣泛應(yīng)用于小動物（如小鼠）的活體電轉(zhuǎn)化。2013年面世的HDEN電轉(zhuǎn)化技術(shù)（high-density distributed electrode network），是一種專門針對哺乳動物細(xì)胞的特性，而開發(fā)的電轉(zhuǎn)化技術(shù)，其開發(fā)目的是為了提高向哺乳動物細(xì)胞內(nèi)傳送外源DNA和藥物的效率。該技術(shù)包含3大部分內(nèi)容，一是施加于細(xì)胞樣品的電波形式，二是細(xì)胞樣品在電擊時的溶液環(huán)境，三是細(xì)胞樣品的培養(yǎng)方法和電擊前預(yù)處理方法。由于該技術(shù)是專門針對哺乳動物細(xì)胞開發(fā)的，因此，上述3大部分內(nèi)容，都是針對哺乳動物細(xì)胞的特性而設(shè)計。在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知，微生物細(xì)胞的特性和培養(yǎng)方法，與哺乳動物細(xì)胞相比，千差萬別。哺乳動物細(xì)胞和微生物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)不同，哺乳動物細(xì)胞沒有細(xì)胞壁，微生物細(xì)胞（比如絕大部分真菌、包括黃曲霉）有細(xì)胞壁。哺乳動物細(xì)胞的細(xì)胞膜和微生物的細(xì)胞膜也不一樣。因此，任何應(yīng)用于哺乳動物細(xì)胞的技術(shù)，都很難直接應(yīng)用于微生物細(xì)胞?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報道了HDEN技術(shù)在HEK-293A，Hela，Neuro-2A，MCF-7，C2C12，3T3-L1，CHO，MDCK，HL-60，HUVEC，A375，U251等哺乳動物細(xì)胞中的應(yīng)用。目前尚未有該技術(shù)在哺乳動物細(xì)胞以外的物種中應(yīng)用的案例報道。因此，HDEN電轉(zhuǎn)化技術(shù)能不能應(yīng)用于哺乳動物細(xì)胞以外的物種，也是一個未知數(shù)。絲狀真菌（包括黃曲霉）是一類真核微生物，很多類型的真菌的基因組是多倍體。對生命個體做基因工程改造時，最困難的就是面對多倍體現(xiàn)象。因為對多倍體的改造，常常效率低下（比如基因打靶可能只命中一條染色體，而脫靶另外一條或幾條同源染色體），而且多倍體在分裂繁殖時，同源染色體分離，也很難把改造位點遺傳給所有子代。這在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知。真菌孢子是真菌的主要繁殖器官，孢子呈休眠狀態(tài)且可以生存很長時間。孢子在適宜的外界條件下，能夠蘇醒并萌發(fā)，形成菌絲而進(jìn)行分裂繁殖。最為重要的是，很多類型真菌的孢子，是天然的單倍體，直接對單倍體孢子進(jìn)行基因工程改造，效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于操作多倍體。但是，由于孢子一般處于休眠狀態(tài)，其細(xì)胞壁非常厚實，休眠孢子的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的狀態(tài)，與萌發(fā)孢子、與菌絲體是不同的。且休眠孢子細(xì)胞內(nèi)的生命活動也處于最不旺盛的狀態(tài)，因此，本領(lǐng)域公知，休眠孢子的細(xì)胞通透性不如萌發(fā)孢子和菌絲，休眠孢子幾乎不與外界交流物質(zhì)，閉關(guān)鎖國，一般處于睡眠狀態(tài)。而萌發(fā)孢子或菌絲體，需要從外界吸收各種營養(yǎng)分子供給生命活動，因此細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性大于休眠孢子。所以，非常難以將外源DNA分子直接導(dǎo)入到睡眠孢子的內(nèi)部?，F(xiàn)有的幾大成熟技術(shù)中：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，作為宿主細(xì)胞的原生質(zhì)體的來源，一般是真菌的菌絲體（多倍體）。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)下，把農(nóng)桿菌和真菌孢子在固體培養(yǎng)基表面共培養(yǎng)數(shù)天，可以把外源DNA導(dǎo)入真菌細(xì)胞。但是這種做法并非是直接對孢子進(jìn)行轉(zhuǎn)化，因為在共培養(yǎng)過程中，真菌孢子會萌發(fā)，然后農(nóng)桿菌侵襲萌發(fā)孢子，才能導(dǎo)入外源DNA。而且農(nóng)桿菌法，需要農(nóng)桿菌作為介導(dǎo)的介質(zhì)，需要先做一個農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，才能做后續(xù)的真菌轉(zhuǎn)化，因此操作非常復(fù)雜和繁瑣，且周期長。傳統(tǒng)的電擊轉(zhuǎn)化法（使用的是指數(shù)衰減波電擊），宿主細(xì)胞采用的是萌發(fā)的真菌孢子。例如Ozeki等創(chuàng)立的針對真菌孢子的電擊方法，必須要讓孢子萌發(fā)后，才能電擊轉(zhuǎn)化（該方法披露了讓孢子萌發(fā)的具體實驗步驟和細(xì)節(jié)）。該方法是行業(yè)內(nèi)首創(chuàng)的經(jīng)典技術(shù)，目前為止無顯著改進(jìn)，一直被本領(lǐng)域人員沿用至今。本申請專利技術(shù)人也嘗試過用該方法轉(zhuǎn)化未萌發(fā)孢子，沒有成功，目前，也沒有任何成功的文獻(xiàn)報道。Ozeki等創(chuàng)立的方法見文獻(xiàn)1：OZEKI K, KYOYA F, HIZUME K, KANDA A, HAMACHI M, NUNOKAWA Y. Transformation of intact Aspergillus niger by electroporation [J]. Biosci Bi本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】
一種對黃曲霉休眠孢子轉(zhuǎn)化外源DNA的方法，其特征在于：所述方法包括以下步驟：1）黃曲霉培養(yǎng)和孢子收集在固體瓊脂培養(yǎng)基表面接種黃曲霉，培養(yǎng)至培養(yǎng)基表面長滿黃曲霉孢子，洗下培養(yǎng)基表面的黃曲霉孢子，吸出孢子懸液并過濾去除菌絲，收集含有孢子的濾液，將濾液離心，收集沉淀的休眠孢子；2）黃曲霉孢子預(yù)處理用電擊緩沖液重懸孢子，離心并收集孢子沉淀，重復(fù)上述重懸和離心步驟3?4次后，將最后收集的孢子沉淀重懸于電擊緩沖液中，得到孢子濃度為104?1011個/ml的黃曲霉孢子懸液；所述電擊緩沖液由終濃度為0.01?100mmol/L的4?羥乙基哌嗪乙磺酸和終濃度為0.5?5000mmol/L的甘露醇組成，電擊緩沖液的pH為3.0?9.5；3）使用HDEN法電擊黃曲霉孢子在細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中加入上述步驟得到的黃曲霉孢子懸液以及待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，混勻，得到孢子與質(zhì)?；旌衔?，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于冰上冰浴10?15min，然后采用Etta?Biotech?X?Porator?H1電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行HDEN法電擊，將帶有矩陣式電極的電擊頭插入孢子與質(zhì)?；旌衔飪?nèi)部，通電，使得孢子與質(zhì)?；旌衔飪?nèi)部產(chǎn)生電場，電擊之后再將細(xì)胞培養(yǎng)板置于冰上冰浴10?15min，然后將孢子和質(zhì)粒混合物吸出，得到導(dǎo)入外源DNA的休眠的黃曲霉孢子；所述黃曲霉懸液與待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的比例為：6?600000μl的黃曲霉孢子懸液：0.1?10000μg的待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒；所述電擊參數(shù)如下：電壓1?6000V，脈寬2?2000000ms，重復(fù)1?100次，每次間隔5?50000ms。...

【技術(shù)特征摘要】
1.一種對黃曲霉休眠孢子轉(zhuǎn)化外源DNA的方法，其特征在于：所述方法包括以下步驟：1）黃曲霉培養(yǎng)和孢子收集在固體瓊脂培養(yǎng)基表面接種黃曲霉，培養(yǎng)至培養(yǎng)基表面長滿黃曲霉孢子，洗下培養(yǎng)基表面的黃曲霉孢子，吸出孢子懸液并過濾去除菌絲，收集含有孢子的濾液，將濾液離心，收集沉淀的休眠孢子；2）黃曲霉孢子預(yù)處理用電擊緩沖液重懸孢子，離心并收集孢子沉淀，重復(fù)上述重懸和離心步驟3-4次后，將最后收集的孢子沉淀重懸于電擊緩沖液中，得到孢子濃度為104-1011個/ml的黃曲霉孢子懸液；所述電擊緩沖液由終濃度為0.01-100mmol/L的4-羥乙基哌嗪乙磺酸和終濃度為0.5-5000mmol/L的甘露醇組成，電擊緩沖液的pH為3.0-9.5；3）使用HDEN法電擊黃曲霉孢子在細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中加入上述步驟得到的黃曲霉孢子懸液以及待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，混勻，得到孢子與質(zhì)粒混合物，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于冰上冰浴10-15min，然后采用Etta Biotech X-Porator H1電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行HDEN法電擊，將帶有矩陣式電極的電擊頭插入孢子與質(zhì)?；旌衔飪?nèi)部，通電，使得孢子與質(zhì)?；旌衔飪?nèi)部產(chǎn)生電場，電擊之后再將細(xì)胞培養(yǎng)板置于冰上冰浴10-15min，然后將孢子和質(zhì)?；旌衔镂?，得到導(dǎo)入外源DNA的休眠的黃曲霉孢子；所述黃曲霉懸液與待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的比例為：6-600000μl的黃曲霉孢子懸液：0.1-10000μg的待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒；所述電擊參數(shù)如下：電壓1-6000V，脈寬2-2000000ms，重復(fù)1-100次，每次間隔5-50000ms。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種對黃曲霉休眠孢子轉(zhuǎn)化外源DNA的方法，其特征在于：所述步驟1）的培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基或察氏培養(yǎng)基。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種對黃曲霉休眠孢子轉(zhuǎn)化外源DNA的方法，其特征在于：...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：林峻，
申請(專利權(quán))人：福州大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：福建;35