抗體蛋白二硫鍵配對(duì)分析方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及抗體蛋白二硫鍵配對(duì)分析方法，該方法依次包括如下步驟：1)、對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行去除N?糖處理；2)、對(duì)除去N?糖的蛋白質(zhì)進(jìn)行變性處理；3)、在非還原條件下使用特異性酶酶解變性處理后的蛋白質(zhì)；4)、將酶解后的所述蛋白質(zhì)分成兩份樣品，對(duì)其中一份樣品進(jìn)行還原，對(duì)另一份樣品不進(jìn)行還原，兩份樣品均終止酶解；5)、對(duì)終止酶解后的樣品的二硫鍵肽段進(jìn)行質(zhì)量肽譜圖分析。該方法克服了現(xiàn)有技術(shù)中N?糖對(duì)特異性酶酶解蛋白時(shí)的空間位阻作用以及肽段離子化效率的抑制，減少了酶切方式，能準(zhǔn)確確認(rèn)及定位二硫鍵肽段。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及生物
，特別涉及一種抗體二硫鍵配對(duì)分析方法。
技術(shù)介紹
二硫鍵即S-S鍵，是2個(gè)巰基被氧化而形成的-S-S-形式的硫原子間的共價(jià)鍵，是一種常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，交聯(lián)多肽鏈內(nèi)或鏈間的兩個(gè)半胱氨酸，在形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)、保持正確的空間構(gòu)象、調(diào)節(jié)生物學(xué)活性方面起著非常重要的作用。二硫鍵正確配對(duì)利于肽鏈迅速折疊并形成緊密的、穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，形成局部疏水中心，能阻止水分子進(jìn)入肽的內(nèi)部破壞氫鍵，形成穩(wěn)定的高級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。二硫鍵只具有相對(duì)的穩(wěn)定性，其共價(jià)鍵容易被還原而斷裂，當(dāng)二硫鍵被斷開還原為巰基基團(tuán)時(shí)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及構(gòu)象必然發(fā)生改變，可能完全或部分喪失原有的生物學(xué)功能，巰基含量較高的抗體具有較低的生物活性和較低的熱穩(wěn)定性(Chader jian WB，Chin ET，Harris RJ，et al.Effect of copper sulfate on performance of a serum-free CHO cell culture process and the level of free thiol in the recombinant antibody expressed.Biotechnology Progress 2005；21(2):550-553；Lacy ER,Baker M,Brigham-Burke M.Free sulfhydryl measurement as an indicator of antibody stability.Analytical Biochemistry 2008；382:66-8)。正確的二硫鍵配對(duì)方式對(duì)抗體蛋白藥物生物學(xué)活性至關(guān)重要，錯(cuò)配或不能完全形成二硫鍵往往意味活性的降低(Ouellette D,Alessandri L,Chin A,Grinnell C,Tarcsa E,Radziejewski C,et al.Studies in serum support rapid formation of disulfide bond between unpaired cysteine residues in the VH domain of an immunoglobulin G1molecule.Analytical Biochemistry 2010；397:37-47)。在細(xì)胞株克隆篩選、純化工藝確認(rèn)、制劑配方篩選、產(chǎn)品穩(wěn)定性確認(rèn)等研發(fā)周期過(guò)程中，監(jiān)控二硫鍵配對(duì)可以判斷抗體蛋白工藝開發(fā)。現(xiàn)有的技術(shù)方法多是采用幾種特異性酶進(jìn)行聯(lián)合酶解來(lái)確認(rèn)抗體的二硫鍵配對(duì)形式。西妥昔單抗(Cetuximab，)是一種嵌合型抗體蛋白，目前已在多
個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)用于治療結(jié)直腸癌，是一種重要的抗癌藥物，其包括6對(duì)鏈內(nèi)二硫鍵，1對(duì)鏈間二硫鍵和1對(duì)鉸鏈區(qū)二硫鍵。但是，目前對(duì)西妥昔單抗二硫鍵分析需要采用多種特異性酶進(jìn)行聯(lián)合酶解才能確認(rèn)，非常不方便。因此，一種簡(jiǎn)單、有效的抗體蛋白(如Cetuximab)二硫鍵配對(duì)分析方法仍是目前急需的。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一種抗體蛋白二硫鍵配對(duì)分析方法，該方法克服了現(xiàn)有二硫鍵配對(duì)分析技術(shù)中N-糖對(duì)特異性酶酶解蛋白時(shí)的空間位阻作用和對(duì)肽段離子化效率的抑制作用，以及需要使用多種酶切方式的缺點(diǎn)，僅通過(guò)較少的酶切方式，即能準(zhǔn)確確認(rèn)及定位二硫鍵肽段。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采用以下技術(shù)方案：一種蛋白質(zhì)二硫鍵配對(duì)分析方法，所述方法包括步驟：1、對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行去除N-糖(N-Glycosylations)處理；2、對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行變性處理；3、在非還原條件下使用特異性酶酶解蛋白質(zhì)；4、將酶解后的蛋白質(zhì)分成兩份樣品，對(duì)其中一份樣品進(jìn)行還原，對(duì)另一份樣品不進(jìn)行還原，兩份樣品均終止酶解；5、對(duì)終止酶解后的樣品進(jìn)行質(zhì)量肽譜圖分析。較佳的，所述蛋白質(zhì)為抗體蛋白；進(jìn)一步的，所述抗體蛋白為含N-糖鏈的抗體蛋白，最優(yōu)選為西妥昔單抗(Cetuximab)。較佳的，步驟1中使用肽N-糖苷酶F(PNGase F)去除所述蛋白質(zhì)的N-糖；優(yōu)選溶液pH值為7.0～8.0。較佳的，步驟1中使用鹽酸胍(GuHCl)對(duì)所述蛋白質(zhì)進(jìn)行變性處理；優(yōu)選變性樣品體系中鹽酸胍濃度為5M～7.6M。較佳的，步驟2中所述特異性酶為胰蛋白酶和/或絲氨酸蛋白酶Lys-C；優(yōu)選胰蛋白酶的用量為1﹕20(wt/wt，酶/蛋白)；優(yōu)選Lys-C的用量為1﹕200(wt/wt，酶/蛋白)。在一具體實(shí)例中，所述胰蛋白酶的用量為1﹕20(wt/wt，酶/蛋白)，Lys-C的用量為1﹕200(wt/wt，酶/蛋白)。較佳的，步驟3中使用DTT對(duì)所述其中一份樣品進(jìn)行還原；優(yōu)選樣品體系中DTT濃度為60mM。較佳的，步驟4中加入甲酸FA終止酶解；優(yōu)選FA終體積濃度為0.1％。在另一具體實(shí)例中，對(duì)步驟4中所述其中一份樣品加入0.1M DTT，于37℃水浴孵育30min；兩份樣品均分別加入甲酸FA至終體積濃度0.1％，終止酶解反應(yīng)。較佳的，步驟5中，所述蛋白質(zhì)的二硫鍵配對(duì)確認(rèn)是通過(guò)ESI-Q-TOF MS方法進(jìn)行分析，所得數(shù)據(jù)采用BiopharmaLynx軟件進(jìn)行處理分析。在另一具體實(shí)例中，ESI-Q-TOF MS分析采用以下方法實(shí)現(xiàn)：將蛋白質(zhì)用50mM NH4HCO3(pH8.0)溶液稀釋至1.5-2mg/mL(以酶解前蛋白濃度計(jì))；然后Waters Acquity UPLC BEH300C181.7μm 2.1×150mm色譜柱分離；進(jìn)行Q-TOF質(zhì)譜分析。本專利技術(shù)專利抗體蛋白西妥昔單抗(Cetuximab)輕鏈含有5個(gè)半胱氨酸Cys，分別為Cys23、Cys88、Cys134、Cys194、Cys214，重鏈含11個(gè)半胱氨酸Cys，分別為Cys22、Cys95、Cys146、Cys 202、Cys222、Cys228、Cys231、Cys263、Cys323、Cys369、Cys427，從輕鏈N-末端開始到C-末端分別標(biāo)示為1C～5C，從重鏈N-末端開始到C-末端分別標(biāo)示為6C～16C，理論配對(duì)鏈內(nèi)二硫鍵為1C/2C、3C/4C、6C/7C、8C/9C、13C/14C、15C/16C，鏈間二硫鍵為5C/10C，鉸鏈區(qū)二硫鍵為11C+12C/11C+12C。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)利用特異性脫糖酶去除抗體蛋白N-糖后再進(jìn)行蛋白變性后酶解，可以排除抗體蛋白N-糖對(duì)特異性酶在酶解解蛋白時(shí)的空間位阻作用，降低N-糖對(duì)肽段離子化效率的抑制，從而克服現(xiàn)有技術(shù)對(duì)含有N-糖位點(diǎn)二硫鍵肽段需要采用酶切位點(diǎn)較多特異性酶聯(lián)合胰蛋白酶才能確認(rèn)的缺點(diǎn)；且實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單一酶胰蛋白酶酶切時(shí)不能確認(rèn)西妥昔單抗的5C/10C和11C+12C/11C+12C兩條二硫鍵肽段，單一酶Lys-C酶切時(shí)不能確認(rèn)1C/2C和6C/7C兩條二硫鍵肽段，而胰蛋白酶聯(lián)合Lys-C酶切可以確認(rèn)西妥昔單抗全部二硫鍵肽段，避免Lys-C酶切時(shí)造成的肽段較長(zhǎng)碎片離子不豐富的缺點(diǎn)，也避免了胰蛋白酶酶切時(shí)專一性不夠易產(chǎn)生部分漏切導(dǎo)致肽段豐度較低的缺點(diǎn)。總之，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)具有如下的有益效果：本專利技術(shù)通過(guò)去除抗體蛋白N-糖后再進(jìn)行蛋白變性后酶解，僅需胰蛋白酶聯(lián)合Lys-C酶切方式即可確認(rèn)西妥昔單抗全部本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種蛋白質(zhì)二硫鍵配對(duì)分析方法，依次包括如下步驟：1)、對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行去除N?糖處理；2)、對(duì)除去N?糖的蛋白質(zhì)進(jìn)行變性處理；3)、在非還原條件下使用特異性酶酶解變性處理后的蛋白質(zhì)；4)、將酶解后的所述蛋白質(zhì)分成兩份樣品，對(duì)其中一份樣品進(jìn)行還原，對(duì)另一份樣品不進(jìn)行還原，兩份樣品均終止酶解；5)、對(duì)終止酶解后的樣品的二硫鍵肽段進(jìn)行質(zhì)量肽譜圖分析。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種蛋白質(zhì)二硫鍵配對(duì)分析方法，依次包括如下步驟：1)、對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行去除N-糖處理；2)、對(duì)除去N-糖的蛋白質(zhì)進(jìn)行變性處理；3)、在非還原條件下使用特異性酶酶解變性處理后的蛋白質(zhì)；4)、將酶解后的所述蛋白質(zhì)分成兩份樣品，對(duì)其中一份樣品進(jìn)行還原，對(duì)另一份樣品不進(jìn)行還原，兩份樣品均終止酶解；5)、對(duì)終止酶解后的樣品的二硫鍵肽段進(jìn)行質(zhì)量肽譜圖分析。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟1)中使用肽N-糖苷酶F去除所述蛋白質(zhì)的N-糖。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟2)中使用鹽酸胍溶液對(duì)去除了N-糖的蛋白質(zhì)進(jìn)行變性處理。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟3)中所述特...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：呂鋒華，黃黎明，環(huán)民霞，劉周陽(yáng)，譚青喬，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：三生國(guó)健藥業(yè)上海股份有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：上海;31