本發明專利技術屬基因技術領域，本發明專利技術涉及一種用于檢測X盒結合蛋白1s基因表達水平的引物組合。用于檢測人源性X盒結合蛋白1s基因表達水平的引物組合。本發明專利技術設計的兩套引物可特異性檢測XBP1s和RPL19基因的mRNA表達水平，無非特異性擴增，所選擇的管家基因表達水平不受內質網應激影響，可對XBP1s基因的表達水平進行準確定量。本發明專利技術的檢測系統采用SYBR?green熒光染料方法，無需使用探針，試劑使用方便，只需加入相關檢測模板即可，不需要繁瑣的操作步驟，檢測只需?1.2h即可完成。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬基因
，本專利技術涉及一種用于檢測X盒結合蛋白1s基因表達水平的引物組合。
技術介紹
X盒-結合蛋白1（X box-binding protein1,XBP1）mRNA為轉錄因子ATF6的誘導產物，XBP1 mRNA編碼具有堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper，Bzip）結構的轉錄因子。XBPl作為未折疊蛋白反應的一個重要轉錄因子，具有兩種類型：剪接型的XBPls和非剪接型的XBPlt。磷酸化激活肌醇依賴酶1（inositol requiring enzyme1,IRE1）的核酸內切酶活性，可以與底物XBP1t前體mRNA分子結合，并剪切其26個堿基的內含子，產生新的mRNA轉錄本，翻譯生成有活性的轉錄因子X盒-結合蛋白1s（X box binding protein 1 splicing，XBP1s）。XBP1s進入細胞核后與內質網應激反應元件的基因啟動子結合，誘導CHOP、GRP78等分子伴侶和折疊酶基因的表達，上調內質網相關蛋白降解，加快蛋白折疊和錯誤蛋白降解。XBPls參與細胞分化、炎癥反應等過程。研究發現XBPls在肝細胞癌中高度表達，其通過與Ⅱ型主要組織相容性復合物(HLA)基因啟動子結合調控其表達。XBP1s是細胞分化的一個調控因子，可促進細胞分化，Reimold等發現XBPl是調控肝細胞生長的一個重要轉錄因子，同位素示蹤技術證實XBPl基因敲除小鼠的肝組織中肝細胞生長率降低、凋亡細胞增多。另有研究發現XBP1s可能通過激活JNK信號通路介導了IL-1β誘導的腹膜間皮細胞的炎癥反應。XBPls與各種細胞的存活與凋亡密切相關。Gomez等研究發現，XBPls的過度表達能降低乳腺癌細胞中雌激素受體的依賴性，改變了許多與細胞凋亡和細胞周期有關的基因表達，通過影響線粒體凋亡通路的活性促進MCF-7和T47D細胞的存活。在氧化應激介導的細胞損傷過程中，XBPls具有重要的保護作用，過度表達XBPls能夠恢復XBPl缺失細胞中過氧化氫酶的表達，起到保護細胞不受損傷的作用。對糖尿病腎臟損害的研究發現，高糖刺激細胞XBP1s的表達降低，細胞外基質蛋白合成增加，導致細胞凋亡與壞死增加。可見XBP1s與多種疾病的發生、發展過程相關，通過對不同疾病模型中XBP1s表達水平的研究可為許多疾病的研究提供了新的思路，為進一步闡明疾病的發病機制提供了新的方法。對XBP1s表達水平的研究除采用免疫組化、ELISA和Western免疫印跡等方法從蛋白水平進行研究外，也可從mRNA水平研究XBP1s的表達水平,包括半定量反轉錄PCR和熒光定量PCR方法等。以蛋白為檢測目標的方法通常操作比較繁瑣，耗時。半定量反轉錄PCR需要電泳檢測，準確度不夠高。熒光定量PCR方法是一種高靈敏度、簡便快捷的檢測方法，操作簡單,可應用SYBR green染料法檢測，無需使用熒光探針，設計簡單，采用熒光定量PCR相對定量方法通過與表達水平相對穩定的管家基因比較來反映目的基因的表達水平，能很好的輔助XBP1s表達水平的研究，整個PCR反應過程只需1.2小時即可完成。細胞管家基因需選擇維持細胞最低限度功能所不可少的、在所有細胞中均要表達的一類基因，且表達水平受環境因素影響較小。有研究表明比較常用的actin管家基因受內質網應激影響，表達量會減少，不適宜用于內質網應激的參考基因。核糖體蛋白基因產物是維持細胞生命活動所必須的，表達于所有細胞中，其表達只受啟動序列或啟動子與RNA聚合酶相互作用的影響，而不受其他機制調節,可用作內質網應激的參考基因。
技術實現思路
本專利技術通過設計人源性XBP1s基因的特異性引物和核糖體蛋白RPL19基因的特異性引物，將其用于XBP1s基因表達水平的檢測。本專利技術的工作原理是應用熒光定量PCR SYBR green熒光染料的方法根據相對定量原理，即2-△△CT法確定基因表達水平。本專利技術包含兩套引物系統，一套引物是針對人源性XBP1s基因的特異性引物；另一套引物是針對人的核糖體蛋白RPL19基因設計的特異性引物。根據NCBI公布的human XBP1s mRNA序列（序列號：NM_001079539.1）設計XBP1s引物序列見表1：表1.XBP1s引物設計引物名稱序列F-XBP1sCTGAGTCCGCAGCAGGTGR-XBP1sTGTCCAGAATGCCCAACAGG根據NCBI公布的human RPL19的mRNA序列（序列號：NM_000981.3）設計引物序列見表2：表2.RPL19引物設計引物名稱序列F-rplCGAGCGAGCTCTTTCCTTTR-rplAGACCTTCTTCTTGCCACAGC技術效果 本專利技術設計的兩套引物可特異性檢測XBP1s和RPL19基因的mRNA表達水平，無非特異性擴增，所選擇的管家基因表達水平不受內質網應激影響，可對XBP1s基因的表達水平進行準確定量。本專利技術的檢測系統采用SYBR green熒光染料方法，無需使用探針，試劑使用方便，只需加入相關檢測模板即可，不需要繁瑣的操作步驟，檢測只需 1.2h即可完成。附圖與說明附圖1為本專利技術實施例1中 XBP1s和RPL19基因擴增產物的融解曲線，其中A圖為XBP1s基因擴增產物的融解曲線；B圖為RPL19基因擴增產物的融解曲線。附圖2. 為本專利技術實施例2中Manf蛋白對PD細胞模型XBP1s基因表達水平的影響。具體實施方式下面結合附圖和實施例，對本專利技術的具體實施方式作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本專利技術，但不用來限制本專利技術的范圍。本專利技術實施例中采用諾唯贊的Acetaq SYBR supermix，采用25微升反應體系，熒光定量PCR儀采用ABI7500。利用本專利技術的特異性引物組合和方法檢測人源性XBP1s基因表達水平時，基本操作為：步驟1.細胞RNA提取采用商品化試劑盒提取細胞RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度，并控制提取質量OD260/280～2.0。本專利技術實施例采用天根總RNA提取試劑盒提取細胞RNA，具體操作按說明書進行；步驟2.cDNA反轉錄取大約500ng RNA采用商品化試劑盒進行cDNA反轉錄。本實施例采用Takara的商品化試劑盒PrimeScriptTM RT Master Mix（Perfect Real Time）進行反轉錄，具體操作按說明書進行；步驟3.熒光定量PCR反應實驗中每種模板分別加入兩種熒光定量PCR反應體系中分別進行XBP1s和RPL19基因檢測，一種反應體系包含組分如下：1×Acetaq SYBR supermix上游引物（F-XBP1s） 各0.1～0.5μM下游引物（R-XBP1s） 各0.1～0.5μM模板（1:5稀釋的cDNA) 5μl總體積 25μl另一種為：1×Acetaq SYBR supermix上游引物（F-rpl） 各0.1～0.5μM下游引物（R-rpl） 各0.1～0.5μM模板（1:5稀釋的cDNA) 5μl總體積 25μl熒光定量PCR反應條件：95℃ 本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種用于檢測人源性XBP1s基因表達水平的特異性引物組合，該組合包含以下引物序列：XBP1s基因檢測的引物組合：上游引物F?XBP1s：CTGAGTCCGCAGCAGGTG下游引物R?XBP1s：TGTCCAGAATGCCCAACAGGRPL19內參基因檢測的引物組合：上游引物F?rpl：CGAGCGAGCTCTTTCCTTT下游引物R?rpl：AGACCTTCTTCTTGCCACAGC。
【技術特征摘要】
1.一種用于檢測人源性XBP1s基因表達水平的特異性引物組合，該組合包含以下引物序列：XBP1s基因檢測的引物組合：上游引物F-XBP1s：CTGAGTCCGCAGCAGGTG下游引物R-XBP1s：TGTCCAGAATGCCCAACAGGRPL19內參基因檢測的引物組合：上游引物F-rpl：CGAGCGAGCTCTTTCCTTT下游引物R-rpl：AGACCTTCTTCTTGC...
【專利技術屬性】
技術研發人員：蔣明，于麗華，郭佳，章程，
申請(專利權)人：同濟大學蘇州研究院，
類型：發明
國別省市：江蘇;32
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