一種定量測定生物樣品中白蛋白含量的方法及應用技術

一種定量測定生物樣品中白蛋白含量的方法及應用，該方法將ACDM與白蛋白特異性結合并形成熒光綴合物，該綴合物在pH值1-9的條件下可被激發產生穩定的熒光信號，其熒光值強度與白蛋白的濃度成正比，根據檢測到的熒光值可推算出生物樣品中白蛋白的含量。該方法可用于測定血漿、尿液、細胞培養液等多種生物樣品中白蛋白的絕對含量，同時還具有靈敏度高、準確度高、抗環境干擾能力強、易于高通量檢測等優勢。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于醫藥
，具體涉及一種定量測定生物樣品中白蛋白含量的方法及應用。
技術介紹
人血漿白蛋白是血漿中含量最豐富的蛋白，約占到血漿中蛋白總量的50–60％【Biochem.Pharmacol.2005,70，1673】。人白蛋白是由肝臟合成的非糖基化單鏈蛋白，血液中濃度可以達到35-55mg/mL。人血清白蛋白在維持人體健康中發揮著不可替代的重要作用，其不僅能維持血液正常的滲透壓，還肩負運輸脂肪酸、膽色素、氨基酸、類固醇激素、金屬離子和許多藥物分子的重任，同時還具有抗氧化、清除毒物等作用【Nat.Struct.Biol.1998,5,827】。白蛋白的多個位點可結合各類內源性及外源性物質，從而影響上述物質在體內的轉運及處置。多種疾病，比如肝病(尤其是肝硬化)、腎病綜合癥、腫瘤、蛋白丟失性腸病、燒傷以及營養不良等會導致血清白蛋白的水平下降，而高蛋白飲食以及慢性脫水則會造成白蛋白水平升高。因此人血中白蛋白含量的定量測定已作為臨床常規檢測項目并被廣泛用于多種疾病的輔助診斷。大量臨床實踐已證實，監測血中白蛋白水平對于肝腎功能異常患者的早期診斷以及疾病的愈后都有十分重要的診斷參考價值。更為重要的是，尿液中出現微量白蛋白一般可作為腎臟疾病(如糖尿病、高血壓、鏈球菌感染后的腎小球腎炎)、血管內皮功能障礙、心臟疾病以及靜脈血栓栓塞的標志物及診斷指標【J.Am.Soc.Nephrol.2006,17,2120】。此外，血漿及白蛋白制品在存放和運輸過程中往往會造成部分白蛋白變性從而給患者帶來不可預料的后果。因此，準確評判血漿及白蛋白制品的質量對于臨床治療也具有重要意義。目前，白蛋白的檢測和定量方法包括：電泳法、免疫法和染料結合法等方法。其中電泳法耗時耗力，特異性較差，易造成白蛋白濃度的高估【Clinical Chemistry:Theory,Analysis,Correlation,Mosby,5th edition,2009】。而免疫法雖然其特異性較好，但成本較高，因此目前臨床應用較少。染料結合顯色法應用相對較為廣泛，溴甲酚綠(bromocresol green)和溴甲酚紫(bromocresol purple)作為簡單、便宜且特異性相對較好的兩種染料分子，在臨床上被較多的用來定量白蛋白。但由于這兩種染料的靈敏度較低、無法保證定量的準確性，常出現高估【J Clin Pathol.2003,56,780.】或低估現象【Clin.Chim.Acta.1986,155,83.】，且不可避免受到生物樣品中的非特異性干擾【Clin.Chem.2009,55,583.】。本專利技術提到的方法屬于染料結合法，相比于目前的幾種染料，其具有簡單易操作、特異性高、準確可靠等特點。本專利技術提供了一種定量測定生物樣品中白蛋白含量的方法及應用，具體為ACDM可與白蛋白特異性結合生成熒光綴合物。該熒光綴合物在生理pH值條件下被激發后(激發波長λex＝560nm)產生穩定的熒光信號(發射波長λem＝612nm)。其熒光值強度與白蛋白的濃度成正比，根據檢測到的熒光值可推算出生物樣品中白蛋白的含量。該方法可用于測定血漿、尿液、細胞培養液等多種生物樣品中白蛋白的絕對含量，同時還具有靈敏度高、準確度高、抗環境干擾能力強、易于高通量檢測等優勢。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種定量測定生物樣品中白蛋白含量的方法及其應用。具體為ACDM可與白蛋白特異性結合生成熒光綴合物。該熒光綴合物在生理pH值條件下被激發后(激發波長λex＝560nm)產生穩定的熒光信號(發射波長λem＝612nm)。其熒光值強度與白蛋白的濃度成正比，根據檢測到的熒光值可
推算出生物樣品中白蛋白的含量。該方法可用于測定血漿、尿液、細胞培養液等多種生物樣品中白蛋白的絕對含量，同時還具有靈敏度高、準確度高、抗環境干擾能力強、易于高通量檢測等優勢。一種定量測定生物樣品中白蛋白的方法，將ACDM與白蛋白特異性結合并形成熒光綴合物，該綴合物在pH值1-9的條件下可被激發產生穩定的熒光信號，其熒光值強度與白蛋白的濃度成正比，根據檢測到的熒光值可推算出生物樣品中白蛋白的含量；反應式如下：該方法具體按照以下步驟進行：(1)A液配制：配制pH 5.5-9.5磷酸鹽緩沖液0.1M，(2)將待測樣本加入A液中混勻并孵育1-3min，孵育溫度為0-60℃，(3)B液配制：以ACDM作為特異性結合配體，配制2mM的ACDM溶液，溶劑選擇二甲基亞砜、甲醇或乙腈；(4)樣本測定：將步驟(2)中孵育好的溶液加入B液，混勻后用熒光檢測儀檢測，激發波長560nm，發射波長612nm；讀取熒光值；同步測定無待測樣本的本底熒光值；(5)標準曲線繪制：配制不同濃度的白蛋白標準曲線工作液(0,5,10,20,50,75,100,200,300,400mg/L)，采用上述流程測定其熒光值并繪制標準曲線；(6)將樣本實測值代入標準曲線換算白蛋白的含量。質控液配制：配制50mg/L的白蛋白標準液(溶于緩沖液中)作為質控樣本，
定期進行方法質控。所述磷酸鹽緩沖液pH優選7.4；孵育溫度優選為37℃。一種定量測定生物樣品中白蛋白的方法的應用，該方法可用于多種白蛋白類產品的質量控制，包括重組表達的白蛋白、白蛋白注射液及含有白蛋白的制劑等各類醫藥產品。一種定量測定生物樣品中白蛋白的方法的應用，該方法可用于臨床樣本的體外常規檢驗，包括人血漿、尿液等臨床樣品中白蛋白含量的定量測定。一種定量測定生物樣品中白蛋白的方法的應用，該方法可用于體外定量評判肝細胞合成白蛋白的功能。該方法檢測原理如下：在生理pH條件下，一分子ACDM與一分子白蛋白特異性結合后產生一分子熒光綴合物，其熒光強度與白蛋白的含量成正比。該方法具有熒光強度增益明顯，檢測靈敏度高、適于高通量檢測等特點。本專利技術提供的白蛋白定量測定方法借助熒光檢測儀實現不同生物樣品中目標蛋白的快速超靈敏檢測，該方法可用于重組表達的白蛋白、含有白蛋白的各類醫藥產品、人血漿、尿液等臨床樣品、體外人肝細胞中白蛋白的定量測定。本專利技術所述白蛋白的定量檢測方法具有以下突出優勢：(1)高特異性：該方法具有良好的特異性(如圖1所示)，ACDM可與白蛋白高特異性地結合成熒光綴合物(如圖4所示)；(2)高靈敏度：ACDM具有良好的熒光發射光譜特性(560nm)，該底物與白蛋白結合產物具有熒光發射光譜特征，能較好的進行檢測(如圖4所示)。(3)易高通量檢測：該方法可在實驗室常見各類熒光酶標儀及臨床大生化儀上測定，可利用96或386微孔板進行批量檢測。(4)抗干擾能力強：內源性物質與離子等對該方法定量的影響較小(如圖3
所示)。附圖說明圖1.特異性篩選結果；圖2.ACDM與白蛋白的結合動力學；圖3.抗離子及內源性物質干擾試驗結果；圖4.ACDM-白蛋白綴合物的熒光發射光譜圖(激發波長560nm)；圖5.白蛋白定量標準曲線。具體實施方式下面的實施例將對本專利技術予以進一步的說明，但并不因此而限制本專利技術。所述B液：以ACDM作為特異性結合配體，配制2mM的ACDM溶液，溶劑選擇二甲基亞砜、甲醇或乙腈。實施例1.檢測方法的特異性(1)含有轉鐵蛋白、肌紅蛋白、胃蛋白酶、α-糜蛋白酶、胰蛋白酶、本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種定量測定生物樣品中白蛋白的方法，其特征在于：將ACDM與白蛋白特異性結合并形成熒光綴合物，該綴合物在pH值1?9的條件下可被激發產生穩定的熒光信號，其熒光值強度與白蛋白的濃度成正比，根據檢測到的熒光值可推算出生物樣品中白蛋白的含量；反應式如下：

【技術特征摘要】
1.一種定量測定生物樣品中白蛋白的方法，其特征在于：將ACDM與白蛋白特異性結合并形成熒光綴合物，該綴合物在pH值1-9的條件下可被激發產生穩定的熒光信號，其熒光值強度與白蛋白的濃度成正比，根據檢測到的熒光值可推算出生物樣品中白蛋白的含量；反應式如下：2.如權利要求1所述的一種定量測定生物樣品中白蛋白的方法，其特征在于具體按照以下步驟進行：(1)A液配制：配制pH 5.5-9.5磷酸鹽緩沖液0.1M；(2)將待測樣本加入A液中混勻并孵育1-3min，孵育溫度為0-60℃；(3)B液配制：以ACDM作為特異性結合配體，配制2mM的ACDM溶液，溶劑選擇二甲基亞砜、甲醇或乙腈；(4)樣本測定：將步驟(2)中孵育好的溶液加入B液，混勻后用熒光檢測儀檢測，激發波長560nm，發射波長612nm；讀取熒光值；同步測定無待測樣本的本底熒光值；(5)標準曲線繪制：配制不同濃度的白蛋白標準曲線工...

【專利技術屬性】
技術研發人員：楊凌，崔京南，王一儒，葛廣波，馮磊，金強，
申請(專利權)人：中國科學院大連化學物理研究所，
類型：發明
國別省市：遼寧;21