一種基于氣相色譜質(zhì)譜的煙草種子代謝組學(xué)分析方法技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)公開(kāi)了一種基于氣相色譜質(zhì)譜的煙草種子代謝組學(xué)分析方法，包括樣品前處理、色譜質(zhì)譜分離、代謝物結(jié)構(gòu)鑒定、代謝物的定量分析、數(shù)據(jù)分析步驟。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)采用極性溶劑和非極性溶劑分別萃取煙草種子極性代謝物和非極性代謝物，采用保留指數(shù)和質(zhì)譜譜圖庫(kù)定性鑒定氣相色譜質(zhì)譜所采集的所有代謝物，采用非靶標(biāo)定量分析方法定量分析所采集的所有代謝物。該方法的建立為開(kāi)展煙草種子代謝組學(xué)相關(guān)研究提供了重要的參考。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專(zhuān)利技術(shù)屬于分析化學(xué)
，具體涉及一種基于氣相色譜質(zhì)譜的煙草種子代謝組學(xué)分析方法。
技術(shù)介紹
代謝組學(xué)是對(duì)生物系統(tǒng)因病理生理刺激以及基因、環(huán)境等改變所致動(dòng)態(tài)多參數(shù)代謝應(yīng)答的定性定量研究。代謝組學(xué)是近年來(lái)迅速發(fā)展的一個(gè)研究領(lǐng)域，從1997年提出代謝組學(xué)的概念以來(lái)，在植物、動(dòng)物和微生物研究領(lǐng)域取得了卓有成效的成績(jī)，尤其在植物代謝組學(xué)研究方面許多國(guó)內(nèi)外知名大學(xué)和研究單位都開(kāi)展了相關(guān)研究工作。代謝組學(xué)研究所采用的分析方法主要有核磁共振光譜法、液相色譜質(zhì)譜法、氣相色譜質(zhì)譜法等。到目前為止，氣相色譜質(zhì)譜由于其操作成本低、定性定量能力強(qiáng)以及對(duì)代謝物的覆蓋面廣等特點(diǎn)，已經(jīng)成為植物代謝組學(xué)研究最重要的分析方法之一。煙草是植物生物學(xué)研究非常重要的一種模式植物，也是非常重要的一種經(jīng)濟(jì)植物。目前，人們已在煙草品質(zhì)、抗病、抗蟲(chóng)等方面開(kāi)展了大量的研究，這些研究主要是從基因、環(huán)境等方面展開(kāi)，而從代謝組學(xué)的角度開(kāi)展研究的相關(guān)報(bào)道卻較少。這主要是因?yàn)榇x組學(xué)目前仍是一種不斷完善和發(fā)展的研究方法。由于煙葉是煙草的主要經(jīng)濟(jì)器官，人們對(duì)于煙草的研究主要集中在煙葉上。煙草種子生產(chǎn)是煙葉生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)，煙草種子活力的高低對(duì)煙株田間生長(zhǎng)發(fā)育及煙葉產(chǎn)質(zhì)量有重要作用，煙草種子活力與種子的生理代謝之間存在著密切聯(lián)系。因此建立煙草種子的代謝組學(xué)研究方法具有重要意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)的目的在于提供一種基于氣相色譜質(zhì)譜的煙草種子代謝組學(xué)分析方法。本專(zhuān)利技術(shù)的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，包括樣品前處理、色譜質(zhì)譜分離、代謝物結(jié)構(gòu)鑒定、代謝物的定量分析、數(shù)據(jù)分析步驟，具體包括：A、樣品前處理：將新鮮采集的煙草種子樣品放入研缽，加液氮冷凍，研磨后樣品放入-80℃保存；B、色譜質(zhì)譜分離：1）極性代謝物的提取及衍生化：準(zhǔn)確稱(chēng)取40.0mg已磨好的新鮮煙草種子樣本于1.5mL離心管，加入370μL甲醇、480μL去離子水、450μL甲基叔丁基醚和200μL內(nèi)標(biāo)溶液，超聲，離心，取下清液600μL，放入凍干機(jī)離心濃縮2小時(shí)以去掉溶劑，取出樣品加入100μL甲氧胺溶液，37℃恒溫肟化90min，加入80μLMSTFA，37℃恒溫硅烷化30min，衍生完的樣品轉(zhuǎn)至氣相色譜質(zhì)譜儀分析，進(jìn)樣量1μL；2）非極性代謝物的提取：準(zhǔn)確稱(chēng)取100.0mg已磨好的新鮮煙草種子樣本，加入4.9mL二氯甲烷和100μL內(nèi)標(biāo)溶液，超聲30min，離心，取上清液2mL氮?dú)獯蹈桑尤?00μL二氯甲烷復(fù)溶，復(fù)溶后提取液轉(zhuǎn)至氣相色譜質(zhì)譜儀分析，進(jìn)樣量1μL；C、代謝物結(jié)構(gòu)鑒定：采用質(zhì)譜去卷積和譜圖庫(kù)檢索、保留指數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)化合物驗(yàn)證相結(jié)合的方法進(jìn)行化合物定性；D、代謝物的定量分析：將代謝物的峰面積與內(nèi)標(biāo)物的峰面積相除，獲得相對(duì)定量信息，具體計(jì)算公式如下：其中，Cx和C1分別代表代謝物x和內(nèi)標(biāo)的含量，μg/g；Ax和A1分別代表代謝物x和內(nèi)容的色譜峰面積；E、數(shù)據(jù)分析：將每個(gè)分析樣本中極性代謝物和非極性代謝物的定量分析結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用主成分分析和聚類(lèi)分析作為多變量分析方法，進(jìn)行樣本之間的相對(duì)關(guān)系研究，采用T檢驗(yàn)作為單變量統(tǒng)計(jì)分析方法，尋找關(guān)鍵代謝物。本專(zhuān)利技術(shù)采用極性溶劑和非極性溶劑分別萃取煙草種子極性代謝物和非極性代謝物，采用保留指數(shù)和質(zhì)譜譜圖庫(kù)定性鑒定氣相色譜質(zhì)譜所采集的所有代謝物，采用非靶標(biāo)定量分析方法定量分析所采集的所有代謝物。該方法的建立為開(kāi)展煙草種子代謝組學(xué)相關(guān)研究提供了重要的參考。附圖說(shuō)明圖1為云煙97成熟前期和后期種子的主成分分析得分圖（左）和載荷圖（右）；圖2為云煙97成熟前期和后期種子代謝物無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)分析圖；圖3為云煙97成熟前期和后期種子代謝物的T檢驗(yàn)結(jié)果火山圖；圖4為煙草種子極性代謝物的氣相色譜質(zhì)譜分析總離子流圖；圖5為煙草種子非極性代謝物的氣相色譜質(zhì)譜分析總離子流圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本專(zhuān)利技術(shù)作進(jìn)一步的說(shuō)明，但不以任何方式對(duì)本專(zhuān)利技術(shù)加以限制，基于本專(zhuān)利技術(shù)教導(dǎo)所作的任何變換或替換，均屬于本專(zhuān)利技術(shù)的保護(hù)范圍。本專(zhuān)利技術(shù)所述的基于氣相色譜質(zhì)譜的煙草種子代謝組學(xué)分析方法，包括樣品前處理、色譜質(zhì)譜分離、代謝物結(jié)構(gòu)鑒定、代謝物的定量分析、數(shù)據(jù)分析步驟，具體包括：A、樣品前處理：將新鮮采集的煙草種子樣品放入研缽，加液氮冷凍，研磨后樣品放入-80℃保存；B、色譜質(zhì)譜分離：1）極性代謝物的提取及衍生化：準(zhǔn)確稱(chēng)取40.0mg已磨好的新鮮煙草種子樣本于1.5mL離心管，加入370μL甲醇、480μL去離子水、450μL甲基叔丁基醚和200μL內(nèi)標(biāo)溶液，超聲，離心，取下清液600μL，放入凍干機(jī)離心濃縮2小時(shí)以去掉溶劑，取出樣品加入100μL甲氧胺溶液，37℃恒溫肟化90min，加入80μLMSTFA，37℃恒溫硅烷化30min，衍生完的樣品轉(zhuǎn)至氣相色譜質(zhì)譜儀分析，進(jìn)樣量1μL；2）非極性代謝物的提取：準(zhǔn)確稱(chēng)取100.0mg已磨好的新鮮煙草種子樣本，加入4.9mL二氯甲烷和100μL內(nèi)標(biāo)溶液，超聲30min，離心，取上清液2mL氮?dú)獯蹈桑尤?00μL二氯甲烷復(fù)溶，復(fù)溶后提取液轉(zhuǎn)至氣相色譜質(zhì)譜儀分析，進(jìn)樣量1μL；C、代謝物結(jié)構(gòu)鑒定：采用質(zhì)譜去卷積和譜圖庫(kù)檢索、保留指數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)化合物驗(yàn)證相結(jié)合的方法進(jìn)行化合物定性；D、代謝物的定量分析：將代謝物的峰面積與內(nèi)標(biāo)物的峰面積相除，獲得相對(duì)定量信息，具體計(jì)算公式如下：其中，Cx和C1分別代表代謝物x和內(nèi)標(biāo)的含量，μg/g；Ax和A1分別代表代謝物x和內(nèi)容的色譜峰面積；E、數(shù)據(jù)分析：將每個(gè)分析樣本中極性代謝物和非極性代謝物的定量分析結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用主成分分析和聚類(lèi)分析作為多變量分析方法，進(jìn)行樣本之間的相對(duì)關(guān)系研究，采用T檢驗(yàn)作為單變量統(tǒng)計(jì)分析方法，尋找關(guān)鍵代謝物。A步驟中研磨后的樣品粒徑為小于40目。B步驟1）中所述的內(nèi)標(biāo)溶液為100μg/mL的對(duì)羥基香豆酸水溶液。B步驟1）中超聲的頻率為25~45kHz，時(shí)間為20~30min。B步驟1）中離心的離心力≥5000g。B步驟1）中凍干機(jī)離心濃縮的真空度為0.18mbar，溫度為-6℃。B步驟1）中所述的甲氧胺溶液的濃度為20mg/ml。B步驟2）中所述的內(nèi)標(biāo)溶液為100μg/mL的桃醛的二氯甲烷溶液；所述的離心的離心力≥10000g。B步驟中色譜分析條件為：色譜柱為DB-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)，程序升溫條件為60℃保持1min，5℃/min升至280℃，保持15min；進(jìn)樣口溫度為250℃；進(jìn)樣體積為1μL；載氣為氦氣；柱流量為1.1mL/min；分流比為20:1；質(zhì)譜分析條件為：傳輸線溫度為230℃；離子源溫度210℃；非極性代謝物的溶劑延遲時(shí)間為2min，極性衍生化樣品的溶劑延遲時(shí)間為7min；質(zhì)量掃描范圍為m/z35-400；質(zhì)譜掃描速度為5Hz。下面以成熟煙草種子為例進(jìn)行分析，具體為：1、樣品前處理1.1實(shí)驗(yàn)試劑及裝置甲醇（色譜級(jí)）購(gòu)買(mǎi)于德國(guó)Merck公司；超純水由Millipore純化系統(tǒng)制備。對(duì)羥基香豆酸和桃醛（內(nèi)標(biāo)化合物）購(gòu)買(mǎi)于百靈威公司；0#輕質(zhì)柴油（用于保留指數(shù)計(jì)算）購(gòu)自當(dāng)?shù)丶佑驼尽EClarus600GC-MS氣相色譜質(zhì)譜儀（美國(guó)PE公司）；SB-50D超聲波提取儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；DB-5MS毛細(xì)管色譜柱（30m×0.25mm×0.2本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種基于氣相色譜質(zhì)譜的煙草種子代謝組學(xué)分析方法，其特征在于包括樣品前處理、色譜質(zhì)譜分離、代謝物結(jié)構(gòu)鑒定、代謝物的定量分析、數(shù)據(jù)分析步驟，具體包括：A、樣品前處理：將新鮮采集的煙草種子樣品放入研缽，加液氮冷凍，研磨，研磨后樣品放入?80℃保存；B、色譜質(zhì)譜分離：1）極性代謝物的提取及衍生化：準(zhǔn)確稱(chēng)取40.0?mg已磨好的新鮮煙草種子樣本于1.5?mL離心管，加入370?μL甲醇、480?μL去離子水、450?μL甲基叔丁基醚和200?μL內(nèi)標(biāo)溶液，超聲，離心，取下清液600?μL，放入凍干機(jī)離心濃縮2小時(shí)以去掉溶劑，取出樣品加入100?μL甲氧胺溶液，37?℃恒溫肟化90?min，加入80?μL?MSTFA，37?℃恒溫硅烷化30?min，衍生完的樣品轉(zhuǎn)至氣相色譜質(zhì)譜儀分析，進(jìn)樣量?1?μL；2）非極性代謝物的提取：準(zhǔn)確稱(chēng)取100.0?mg已磨好的新鮮煙草種子樣本，加入4.9?mL二氯甲烷和100?μL內(nèi)標(biāo)溶液，超聲30?min，離心，取上清液2?mL氮?dú)獯蹈桑尤?00?μL二氯甲烷復(fù)溶，復(fù)溶后提取液轉(zhuǎn)至氣相色譜質(zhì)譜儀分析，進(jìn)樣量?1?μL；C、代謝物結(jié)構(gòu)鑒定：采用質(zhì)譜去卷積和譜圖庫(kù)檢索、保留指數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)化合物驗(yàn)證相結(jié)合的方法進(jìn)行化合物定性；D、代謝物的定量分析：將代謝物的峰面積與內(nèi)標(biāo)物的峰面積相除，獲得相對(duì)定量信息，具體計(jì)算公式如下：其中，Cx和C1分別代表代謝物x和內(nèi)標(biāo)的含量，μg/g；Ax和A1分別代表代謝物x和內(nèi)容的色譜峰面積；E、數(shù)據(jù)分析：將每個(gè)分析樣本中極性代謝物和非極性代謝物的定量分析結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用主成分分析和聚類(lèi)分析作為多變量分析方法，進(jìn)行樣本之間的相對(duì)關(guān)系研究，采用T檢驗(yàn)作為單變量統(tǒng)計(jì)分析方法，尋找關(guān)鍵代謝物。...

【技術(shù)特征摘要】
1.一種基于氣相色譜質(zhì)譜的煙草種子代謝組學(xué)分析方法，其特征在于包括樣品前處理、色譜質(zhì)譜分離、代謝物結(jié)構(gòu)鑒定、代謝物的定量分析、數(shù)據(jù)分析步驟，具體包括：A、樣品前處理：將新鮮采集的煙草種子樣品放入研缽，加液氮冷凍，研磨，研磨后樣品放入-80℃保存；B、色譜質(zhì)譜分離：1）極性代謝物的提取及衍生化：準(zhǔn)確稱(chēng)取40.0mg已磨好的新鮮煙草種子樣本于1.5mL離心管，加入370μL甲醇、480μL去離子水、450μL甲基叔丁基醚和200μL內(nèi)標(biāo)溶液，超聲，離心，取下清液600μL，放入凍干機(jī)離心濃縮2小時(shí)以去掉溶劑，取出樣品加入100μL甲氧胺溶液，37℃恒溫肟化90min，加入80μLMSTFA，37℃恒溫硅烷化30min，衍生完的樣品轉(zhuǎn)至氣相色譜質(zhì)譜儀分析，進(jìn)樣量1μL；2）非極性代謝物的提取：準(zhǔn)確稱(chēng)取100.0mg已磨好的新鮮煙草種子樣本，加入4.9mL二氯甲烷和100μL內(nèi)標(biāo)溶液，超聲30min，離心，取上清液2mL氮?dú)獯蹈桑尤?00μL二氯甲烷復(fù)溶，復(fù)溶后提取液轉(zhuǎn)至氣相色譜質(zhì)譜儀分析，進(jìn)樣量1μL；C、代謝物結(jié)構(gòu)鑒定：采用質(zhì)譜去卷積和譜圖庫(kù)檢索、保留指數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)化合物驗(yàn)證相結(jié)合的方法進(jìn)行化合物定性；D、代謝物的定量分析：將代謝物的峰面積與內(nèi)標(biāo)物的峰面積相除，獲得相對(duì)定量信息，具體計(jì)算公式如下：其中，Cx和C1分別代表代謝物x和內(nèi)標(biāo)的含量，μg/g；Ax和A1分別代表代謝物x和內(nèi)容的色譜峰面積；E、數(shù)據(jù)分析：將每個(gè)分析樣本中極性代謝物和非極性代謝物的定量分析結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用主成分分析和聚類(lèi)分析作為多變量分析方法，進(jìn)行樣本之間的相對(duì)關(guān)系研究，采用T檢驗(yàn)作為單變量統(tǒng)計(jì)分析方法，尋找關(guān)鍵代謝物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于氣相色譜質(zhì)譜的煙草種子...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李勇，逄濤，師君麗，鄭昀燁，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：云南;53