一種檢測(cè)Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒D抗原含量的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種檢測(cè)Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒D抗原含量的方法，屬于抗原檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明專利技術(shù)采用Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒型別特異性多克隆抗體與單克隆抗體相互配對(duì)的方式，能夠針對(duì)性強(qiáng)地檢測(cè)出Ⅲ型脊灰病毒的D抗原含量，而C抗原則不被檢測(cè)出，該方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果可真實(shí)反映脊髓灰質(zhì)炎病毒的有效抗原含量，可較好的為后續(xù)的脊髓灰質(zhì)炎疫苗免疫原性試驗(yàn)用量和疫苗產(chǎn)品的終濃度提供依據(jù)，最終提高脊髓灰質(zhì)炎疫苗的質(zhì)量，具有良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和市場(chǎng)應(yīng)用價(jià)值。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及抗原檢測(cè)
，具體地，涉及一種檢測(cè)Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒D抗原含量的方法。
技術(shù)介紹
脊髓灰質(zhì)炎病毒(以下簡(jiǎn)稱脊灰病毒)是一種嚴(yán)重危害兒童健康的急性傳染病的RNA病毒。患者多為1～6歲兒童，主要癥狀是發(fā)熱，全身不適，嚴(yán)重時(shí)肢體疼痛，發(fā)生分布不規(guī)則和輕重不等的遲緩性癱瘓，俗稱小兒麻痹癥。目前對(duì)于發(fā)病癥狀的兒童沒(méi)有有效的治療措施，現(xiàn)通常采用疫苗預(yù)防接種的方式對(duì)兒童進(jìn)行疾病防護(hù)。在脊灰疫苗中，D抗原是疫苗的主要成分，其具有較強(qiáng)的免疫原性，能有效激發(fā)人體的免疫應(yīng)答，因此，D抗原的制備及檢測(cè)水平直接影響到疫苗的保護(hù)效果。目前通常采用ELISA法對(duì)脊灰病毒D抗原含量進(jìn)行檢測(cè)，即雙抗體夾心法定量測(cè)定供試品中脊灰病毒的抗原含量。該方法廣泛應(yīng)用于抗體、試劑盒、病毒疫苗等生物制品的研究開(kāi)發(fā)和工業(yè)化生產(chǎn)，是生物制品研究和生產(chǎn)中的常用技術(shù)。但是在脊灰病毒疫苗研究開(kāi)發(fā)過(guò)程中病毒有效成分D抗原，即有致病性的完整病毒顆粒并不是唯一存在的，往往伴隨著無(wú)效成分C抗原，即不完整的或者缺失核酸的病毒顆粒的形成，這種C抗原免疫動(dòng)物后不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的中和保護(hù)抗體。眾所周知，現(xiàn)有技術(shù)無(wú)法明確地分離D抗原和C抗原。根據(jù)文獻(xiàn)研究，通常采用將脊灰病毒供試品進(jìn)行56℃水浴30min滅活后稱為H抗原，由于H抗原為D抗原加熱滅活獲得，動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)證實(shí)H抗原不具免疫原性，因此普遍性認(rèn)為H抗原等效于C抗原。市場(chǎng)上現(xiàn)有脊灰病毒檢測(cè)系統(tǒng)一般針對(duì)脊灰病毒抗原的線性表位，這種線性表位由于不涉及到病毒的空間構(gòu)象，因此廣泛存在于D抗原和C抗原中，也因此造成現(xiàn)有脊灰病毒檢測(cè)系統(tǒng)不能夠有效區(qū)別上述兩者。由于D抗原是免疫動(dòng)物后能產(chǎn)生中和保護(hù)性抗體，是脊灰病毒疫苗的有效成分，而C抗原免疫動(dòng)物后不產(chǎn)生中和保護(hù)性抗體，不是脊灰病毒疫苗的有效成分。因此生物制品企業(yè)在脊灰病毒疫苗研制過(guò)程極力避免D抗原富集過(guò)程中C抗原對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的干擾。鑒于C抗原對(duì)生物制品的生產(chǎn)成本、生產(chǎn)效率及質(zhì)量控制均具有一定的影響，為了保證生物制品的有效性，亟待需要一種可以精確檢測(cè)脊灰病毒D抗原含量的方法，以提高產(chǎn)品的生產(chǎn)效率和質(zhì)量。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一種檢測(cè)Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒D抗原的方法，該方法可以在排除H抗原和C抗原干擾的基礎(chǔ)上對(duì)Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒D抗原含量進(jìn)行檢測(cè)。本專利技術(shù)提供的一種檢測(cè)Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒D抗原含量的方法，是以Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒多克隆抗體作為包被抗體，以Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性單克隆抗體作為檢測(cè)抗體，采用ELISA方法實(shí)現(xiàn)對(duì)Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒D抗原含量的檢測(cè)。所述Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒多克隆抗體為牛多抗，是采用滅活的Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒免疫牛，采血，分離血清制備而來(lái)，其對(duì)于Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒的反應(yīng)優(yōu)于對(duì)Ⅰ、Ⅱ型脊髓灰質(zhì)炎病毒的反應(yīng)。所述Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性單克隆抗體是由保藏編號(hào)為CGMCCNO.9233的雜交瘤細(xì)胞分泌得到。保藏編號(hào)為CGMCCNO.9233的雜交瘤細(xì)胞已在中國(guó)專利CN104371980A中公開(kāi)。進(jìn)一步地，檢測(cè)Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒D抗原含量的方法采用的Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒多克隆抗體為牛多抗，采用滅活的Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒免疫牛，采血，分離血清制備而來(lái)，其對(duì)于Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒的反應(yīng)優(yōu)于對(duì)Ⅰ、Ⅱ型脊髓灰質(zhì)炎病毒的反應(yīng)，Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性單克隆抗體是由保藏編號(hào)為CGMCCNO.9233的雜交瘤細(xì)胞分泌得到。具體地，本專利技術(shù)檢測(cè)Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒D抗原含量的方法是將Ⅲ型脊灰病毒多克隆抗體包被于酶標(biāo)板形成固相抗體；然后加入脊灰病毒供試品，形成固相抗原抗體復(fù)合物；洗板，拍干，再加入Ⅲ型脊灰病毒特異性單克隆抗體，孵育后洗板拍干，最后加入酶標(biāo)記抗種屬抗體，當(dāng)加入底物時(shí)出現(xiàn)成色反應(yīng)，終止液終止反應(yīng)后用酶標(biāo)儀在適當(dāng)波長(zhǎng)測(cè)定OD值，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。或者將Ⅲ型脊灰病毒牛多抗包被于酶標(biāo)板形成固相抗體；然后加入脊灰病毒供試品，形成固相抗原抗體復(fù)合物；洗板，拍干，再加入酶標(biāo)記的Ⅲ型脊灰病毒特異性單克隆抗體，孵育后洗板拍干，當(dāng)加入底物時(shí)出現(xiàn)成色反應(yīng)，終止液終止反應(yīng)后用酶標(biāo)儀在適當(dāng)波長(zhǎng)測(cè)定OD值，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。進(jìn)一步地，Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒多克隆抗體按照1:1000-1:10000稀釋并混勻后加于酶標(biāo)板。進(jìn)一步地，Ⅲ型脊灰病毒特異性單克隆抗體按照1:1000-1:10000的比例稀釋混勻后加于酶標(biāo)板。本專利技術(shù)提供了上述方法在制備脊髓灰質(zhì)炎生物制品及其質(zhì)量控制中的應(yīng)用。本專利技術(shù)提供了上述方法在制備脊髓灰質(zhì)炎病毒檢測(cè)試劑或試劑盒中的應(yīng)用。本專利技術(shù)提供了Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒牛多克隆抗體在制備檢測(cè)Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒D抗原含量試劑盒中的應(yīng)用。由上述技術(shù)方案，本專利技術(shù)檢測(cè)脊髓灰質(zhì)炎病毒D抗原含量的方法至少具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果：(1)排除H抗原和C抗原的干擾，能夠準(zhǔn)確定量脊髓灰質(zhì)炎病毒D抗原；(2)簡(jiǎn)化操作步驟，節(jié)約生產(chǎn)成本與勞動(dòng)力成本；(3)最優(yōu)的控制產(chǎn)品的質(zhì)量和有效性能。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本專利技術(shù)的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本專利技術(shù)的限制。在不背離本專利技術(shù)精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本專利技術(shù)方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本專利技術(shù)的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段；實(shí)施例中所用的試劑為市售商品。保藏編號(hào)為CGMCCNO.9233的Sabin株脊髓灰質(zhì)炎Ⅲ型病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞已在中國(guó)專利CN104371980A中公開(kāi)。實(shí)施例1Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒多克隆抗體的制備將滅活后的Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒與弗氏佐劑乳化，免疫牛和新西蘭大白兔。牛免疫劑量：首免以10ml滅活的Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒與10ml弗氏完全佐劑等體積混合后乳化免疫，其后采用5ml與等體積弗氏不完全佐劑乳化免疫。兔免疫劑量：首免以2ml滅活Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒與2ml弗氏完全佐劑等體積混合后乳化免疫，其后采用1ml與等體積弗氏不完全佐劑乳化免疫。免疫部位：頸背部皮下多點(diǎn)。免疫程序：0、2、4、6周。7周時(shí)采血，分離血清。采用間接ELISA法檢測(cè)多抗血清相對(duì)脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ抗體效價(jià)，考察特異性。以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎滅活病毒分別1:400稀釋100μl/孔包被酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜，洗板后封閉酶標(biāo)板；將兔血清和牛血清從1:1000，2倍梯度稀釋，然后雙孔平行加入酶標(biāo)板。37℃反應(yīng)1小時(shí)，洗板加入1：8000稀釋的抗種屬酶標(biāo)記抗體(購(gòu)自KPL公司)，每孔100μl，37℃孵育60分鐘后洗板，加入顯色液A、B各50μl(購(gòu)自北京勤邦生物技術(shù)有限公司)，室溫孵育10分鐘。再每孔加入50μl自制的2M硫酸終止液，酶標(biāo)儀450nm讀數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1、2。表1ELISA間接檢測(cè)Ⅲ型牛多抗特異性試驗(yàn)OD值表2ELISA間接檢測(cè)Ⅲ型兔多抗特異性試驗(yàn)OD值結(jié)果可見(jiàn)，相同OD值時(shí)，如在0.2-0.4時(shí)，牛多抗對(duì)Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒稀釋為32×104，而對(duì)Ⅰ、Ⅱ型稀釋倍數(shù)為2×104，表明相同反應(yīng)強(qiáng)度下，牛多抗對(duì)Ⅲ型稀釋倍數(shù)更大反應(yīng)更強(qiáng)，與Ⅰ、Ⅱ型相差16倍。而兔多抗在相同試驗(yàn)下相差4倍。由于脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗采用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒混合制備，抗原檢測(cè)時(shí)為了準(zhǔn)確檢測(cè)Ⅲ型D抗原含量，抗體對(duì)其他型別檢出越低越好。因此，牛血清比兔血清更有利于區(qū)分目標(biāo)抗原和非目標(biāo)抗原，更加有效。實(shí)施例2Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒D抗原檢測(cè)方法的建立及線性驗(yàn)證1、包本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種檢測(cè)Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒D抗原含量的方法，其特征在于，以Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒多克隆抗體作為包被抗體，Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性單克隆抗體作為檢測(cè)抗體，采用ELISA方法實(shí)現(xiàn)對(duì)Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒D抗原含量的檢測(cè)。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種檢測(cè)Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒D抗原含量的方法，其特征在于，以Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒多克隆抗體作為包被抗體，Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性單克隆抗體作為檢測(cè)抗體，采用ELISA方法實(shí)現(xiàn)對(duì)Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒D抗原含量的檢測(cè)。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒多克隆抗體為牛多抗，是采用滅活的Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒免疫牛制備而來(lái)，該牛多抗對(duì)于Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒的反應(yīng)優(yōu)于對(duì)Ⅰ、Ⅱ型脊髓灰質(zhì)炎病毒的反應(yīng)。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性單克隆抗體是由保藏編號(hào)為CGMCCNO.9233的雜交瘤細(xì)胞分泌得到。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒多克隆抗體為牛多抗，該多抗采用滅活的Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒免疫牛；所述Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性單克隆抗體是由保藏編號(hào)為CGMCCNO.9233的雜交瘤細(xì)胞分泌得到。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，將Ⅲ型脊灰病毒牛多抗包被于酶標(biāo)板形成固相抗體；然后加入脊灰病毒供試品，形成固相抗原抗體復(fù)合物；洗板，拍干，再加入Ⅲ型脊灰病毒特異性...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：戈小琴，張穎，程會(huì)欣，陳慧芬，蔡芳，高強(qiáng)，尹衛(wèi)東，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：北京科興生物制品有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：北京;11