水稻光溫敏雄性不育pms3和p/tms12?1基因的分子檢測方法及其分子標(biāo)記技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及兩系法雜交水稻選育過程中分子標(biāo)記輔助選擇與雜交稻品種純度鑒定技術(shù)研究領(lǐng)域，特別涉及水稻光溫敏雄性不育pms3和p/tms12?1基因的分子檢測方法及其分子標(biāo)記。該方法包括：特異性dCAPS分子標(biāo)記dpms3?54，其上游引物dpms3?54F的核苷酸序列為5′??ATTTTACTCTTGATGGATGGTC?3′，下游引物dpms3?54R的核苷酸序列為5′??GAATGCCATCTAAACACT?3′；PCR產(chǎn)物被限制性內(nèi)切酶Sal1酶切30min后，經(jīng)3.5%瓊脂糖凝膠140?U電壓電泳45min后可檢測到375bp的大片段是含有pms3（p/tms12?1）基因的水稻材料，而檢測到359bp小片段的是不含pms3（p/tms12?1）基因的水稻材料。該方法檢測確性好、特異性高、操作簡便、成本低廉、實用性強。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及兩系法雜交水稻選育過程中分子標(biāo)記輔助選擇與雜交稻品種純度鑒定技術(shù)研究領(lǐng)域，特別涉及水稻光溫敏雄性不育pms3和p/tms12-1基因的分子檢測方法及其分子標(biāo)記。
技術(shù)介紹
水稻是世界上最為重要的糧食作物之一，全世界約有一半以上的人口以稻米為主糧。雜交水稻品種以其高產(chǎn)、抗病等優(yōu)勢在我國得到大面積的推廣和種植，其比常規(guī)水稻品種增產(chǎn)約20%。近年來，兩系法雜交水稻以其雜交配組自由、可以克服三系不育系細(xì)胞質(zhì)負(fù)效應(yīng)等優(yōu)勢得到廣泛利用和大面積推廣。光溫敏雄性不育系是實現(xiàn)兩系法雜交水稻育種的核心種質(zhì)資源，其在高溫長日照條件下表現(xiàn)為雄性不育可用于制種；而在低溫短日照條件下育性回復(fù)正?？梢宰越环敝场＾r(nóng)墾58S是我國最早發(fā)現(xiàn)的光溫敏雄性不育系，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)將調(diào)控農(nóng)墾58S的光溫敏雄性不育基因pms3定位于水稻第12染色體上并克隆，是一個長鏈非編碼RNA，測序結(jié)果顯示，在農(nóng)墾58S光溫敏雄性不育系中pms3發(fā)生了一個從C到G的點突變。華南農(nóng)業(yè)大學(xué)利用農(nóng)墾58S和農(nóng)墾58S的改良衍生系培矮64S為研究材料，發(fā)現(xiàn)調(diào)控農(nóng)墾58S光敏雄性不育和培矮64S溫敏雄性不育的基因p/tms12-1也位于水稻第12染色體，其同樣也發(fā)生了一個從C到G的點突變。研究結(jié)果進(jìn)一步顯示pms3和p/tms12-1的點突變是同一位置的相同突變，因此我們利用該堿基突的特點，引入堿基錯配的特異引物，結(jié)合限制性內(nèi)切酶的酶切技術(shù)發(fā)展了一種新的dCAPS分子標(biāo)記dpms3-54。由于該標(biāo)記與光溫敏雄性不育pms3和p/tms12-1基因完全連鎖，因此可用于pms3和p/tms12-1基因的檢測，pms3和p/tms12-1基因的分子標(biāo)記輔助選擇、轉(zhuǎn)育，及以光溫敏雄性不育pms3和p/tms12-1基因為母本材料組配的雜交組合純度鑒定，基因型分析顯示等用途。
技術(shù)實現(xiàn)思路
為了解決上述的技術(shù)問題，本專利技術(shù)的第一個目的是提供一組與pms3和p/tms12-1基因完全連鎖的分子標(biāo)記，用于光溫敏雄性不育基因的快速鑒定和篩選；本專利技術(shù)的第二個目的是提供上述采用分子標(biāo)記的水稻光溫敏雄性不育pms3和p/tms12-1基因的分子檢測方法。本專利技術(shù)的檢測方法準(zhǔn)確性好、操作簡單、成本低廉、實用性強。為了實現(xiàn)上述的第一個目的，本專利技術(shù)采用了以下的技術(shù)方案：一種檢測水稻光溫敏雄性不育pms3和p/tms12-1基因的dCAPS分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記的引物對為：dpms3-54F：5′-ATTTTACTCTTGATGGATGGTC-′，dpms3-54R：5′-GAATGCCATCTAAACACT-3′。為了實現(xiàn)上述的第二個目的，本專利技術(shù)采用了以下的技術(shù)方案：水稻光溫敏雄性不育pms3和p/tms12-1基因的分子檢測方法，該方法包括以下的步驟：1）提取待測樣品的DNA，采用分子標(biāo)記dpms3-54標(biāo)記進(jìn)行PCR擴增，分子標(biāo)記dpms3-54的引物對為：dpms3-54F：5′-ATTTTACTCTTGATGGATGGTC-3′；dpms3-54R：5′-GAATGCCATCTAAACACT-3′；PCR擴增條件為95℃預(yù)變性3min、95℃變性30sec、50℃退火30sec、72℃延伸30sec，共35個循環(huán)，最后72℃延伸5min；2）PCR反應(yīng)產(chǎn)物用于Sal1酶切反應(yīng)，酶切方法為：PCR反應(yīng)產(chǎn)物10μl、Sal1限制性內(nèi)切酶0.5μl，濃度為1U/μl、10×FastDigestbuffer2μl，去離子水7.5μl，酶切反應(yīng)在37℃水浴鍋中進(jìn)行，反應(yīng)時間30min，最后加入4μl6×loadingbuffer后于3.5%瓊脂糖凝膠140U電壓電泳45min，在Bio-Rad凝膠成像儀上進(jìn)行拍照；3）待測DNA樣品經(jīng)過PCR擴增和Sal1酶切后，電泳方式能檢測出376bp片段的含pms3和p/tms12-1基因突變位點的水稻材料，而片段大小為359bp的則是無pms3和p/tms12-1基因突變位點的水稻材料。作為優(yōu)選，所述的待測樣品的DNA的提取方法如下：1）取1-2cm長的水稻葉片放入2ml離心管中，放入1顆用于磨碎水稻葉片的鋼珠，再加入500μl2％的CTAB提取液，將離心管放入球磨儀后60赫茲頻率振蕩1min，粉碎水稻葉片，放于65℃水浴30min；2）加入等體積氯仿/異戊醇充分振蕩，氯仿/異戊醇的體積比為24:1，然后放入離心機中12,000rpm離心10min，靜止5min后吸取400μl上清液于1.5ml離心管；3）加入等體積預(yù)冷的異丙醇后上下混勻，放入離心機中12,000rpm離心5min；4）棄上清液并加入500μl70％的乙醇進(jìn)行洗滌；12,000rpm離心5min棄上清液后在離心管底部可見白色的DNA沉淀；5）室溫干燥10-20min后，加入100μl去離子水溶解。作為進(jìn)一步改進(jìn)，100ml的CTAB提取液包括以下的組分：CTAB:2g；1mol/LTris-HclpH8.010ml;0.5mol/LEDTApH8.04ml;Nacl:8.12g。本專利技術(shù)由于采用了上述的技術(shù)方案，特異性分子標(biāo)記dpms3-54是以光溫敏雄性不育pms3和p/tms12-1基因的單堿基突變?yōu)榛A(chǔ)，經(jīng)過PCR擴增并結(jié)合Sal1酶切特點的dCAPS分子標(biāo)記，其與pms3和p/tms12-1基因完全連鎖，特異性高，可用于pms3和p/tms12-1基因的檢測，pms3和p/tms12-1基因的分子標(biāo)記輔助選擇、轉(zhuǎn)育，及以光溫敏雄性不育pms3和p/tms12-1基因為母本材料組配的雜交組合純度鑒定，基因型分析顯示等用途，該檢測方法準(zhǔn)確性好、操作簡單、成本低廉、實用性強。附圖說明圖1為dpms3-54標(biāo)記檢測光溫敏雄性不育系親本N55S（含pms3基因）、常規(guī)水稻品種日本晴及N55S與日本晴的F1雜種電泳圖。其中M為marker，P1：日本晴；P2：N55S；F1：N55S×日本晴。圖2為dpms3-54標(biāo)記檢測不同光溫敏雄性不育系及常規(guī)品種的電泳圖片。其中M：marker；S1：N55S；S2：廣占63-4S；S3：豐39S；S4：湘陵628S；S5：衡農(nóng)S-1；S6：株1S；S7：1892S；P3：明恢63；P4：秀水134；P5：日本晴。圖3為dpms3-54標(biāo)記檢測兩優(yōu)培九種子純度的電泳圖片。其中M：marker；1-24：24份兩優(yōu)培九種子；其中樣品12僅擴增出pms3條帶，是母本培矮64S自交結(jié)實后混入兩優(yōu)培九種子。具體實施方式種植上述光溫敏雄性不育系、常規(guī)水稻品種、群體材料，在杭州正季播種移栽后1周，選取單株葉片1-2cm并提取基因組DNA，采用特異性dCAPS分子標(biāo)記dpms3-54對pms3和p/tms12-1基因進(jìn)行檢測。特異性分子標(biāo)記dpms3-54F的核苷酸序列為5′-ATTTTACTCTTGATGGATGGTC-′，dpms3-54R的核苷酸序列為5′-GAATGCCATCTAAACACT-3′，PCR產(chǎn)物大小376bp，PCR擴增后每個樣品吸取10μl的DNA用于Sal1酶切反應(yīng)，酶切后經(jīng)3.5%瓊脂糖凝膠140U電壓電泳45min檢測，含有pms3和p/tms12-1基因的DNA片段大小為376本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】
一種檢測水稻光溫敏雄性不育pms3和p/tms12?1基因的dCAPS分子標(biāo)記，其特征在于，該分子標(biāo)記的引物對為：dpms3?54F：5′??ATTTTACTCTTGATGGATGGTC?′，dpms3?54R：5′??GAATGCCATCTAAACACT??3′。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種檢測水稻光溫敏雄性不育pms3和p/tms12-1基因的dCAPS分子標(biāo)記，其特征在于，該分子標(biāo)記的引物對為：dpms3-54F：5′-ATTTTACTCTTGATGGATGGTC-′，dpms3-54R：5′-GAATGCCATCTAAACACT-3′。2.水稻光溫敏雄性不育pms3和p/tms12-1基因的分子檢測方法，其特征在于該方法包括以下的步驟：1）提取待測樣品的DNA，采用分子標(biāo)記dpms3-54標(biāo)記進(jìn)行PCR擴增，分子標(biāo)記dpms3-54的引物對為：dpms3-54F：5′-ATTTTACTCTTGATGGATGGTC-3′；dpms3-54R：5′-GAATGCCATCTAAACACT-3′；PCR擴增條件為95℃預(yù)變性3min、95℃變性30sec、50℃退火30sec、72℃延伸30sec，共35個循環(huán)，最后72℃延伸5min；2）PCR反應(yīng)產(chǎn)物用于Sal1酶切反應(yīng)，酶切方法為：PCR反應(yīng)產(chǎn)物10μl、Sal1限制性內(nèi)切酶0.5μl，濃度為1U/μl、10×FastDigestbuffer2μl，去離子水7.5μl，酶切反應(yīng)在37℃水浴鍋中進(jìn)行，反應(yīng)時間30min，最后加入4μl6×loadingbuffer后于3.5%瓊脂糖凝膠140U電壓電泳45min，在Bio-Rad凝膠成像儀上進(jìn)行拍照；3）待測DNA樣品經(jīng)過PCR擴增和Sal1酶切后，電泳方式能檢測出...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：祁永斌，王建軍，王林友，張禮霞，桂君梅，
申請(專利權(quán))人：浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，
類型：發(fā)明
國別省市：浙江;33