一種檢測純黃絲衣霉菌的試劑、實時熒光PCR試劑盒和檢測方法技術

本發明專利技術公開了一種檢測純黃絲衣霉菌(Byssochlamys?fulva)的試劑、實時熒光PCR試劑盒及檢測方法。該試劑包括：上游引物、下游引物、熒光探針，上游引物、下游引物和熒光探針序列如下：上游引物：5′?TTGGAAGGTCTATGAGATGAGGAAT?3′，下游引物：5′?GCGGAGCGTCTTATTGCAAT?3′，熒光探針：5′?TAM?CAACTTAGCTACAATGGCACCTCCGACCT?BHQ2?3′；試劑盒主要包括上游引物、下游引物、熒光探針、PCR緩沖溶液、dNTP、DNA聚合酶和MgCl2；其檢測方法包括：基因組DNA的提取、實時熒光PCR檢測體系及實時熒光PCR檢測。本發明專利技術的有益效果主要體現在：能夠準確的從待測樣品中檢測出純黃絲衣霉菌，具有特異性強、靈敏度高，還能實時直觀地監測PCR擴增過程等優點。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種檢測純黃絲衣霉菌的試劑、實時熒光PCR試劑盒和檢測方法，屬于生物

技術介紹
純黃絲衣霉菌(Byssochlamysfulva)是果汁生產過程中易污染的耐熱霉菌之一，其抗熱力比其他霉菌要強得多，在85℃下經30分鐘或87.7℃下經10分鐘還能生存。純黃絲衣霉菌能在氧氣不足的環境中生長，還能分解食品中的脂肪、蛋白質、碳水化合物等，有強烈破壞果膠質的作用，可使果實軟化和解體，并且產生二氧化碳氣體和有毒有害物質，引起產品變質。被耐熱霉菌污染的果汁在貯存過程中易出現腐敗變質、分層沉淀、甚至胖聽爆裂等現象，出現產品質量問題。純黃絲衣霉目前主要通過傳統的培養、分離和生化方法進行鑒定，整個檢測過程周期長，操作繁瑣耗時，不能滿足企業生產環節產品質量的快速監控，和進出口時果汁產品快速準確檢測的需要。
技術實現思路
本專利技術的第一個目的是提供一種檢測純黃絲衣霉菌(Byssochlamysfulva)的試劑，能夠運用于實時熒光PCR檢測。為此，本專利技術采用以下技術方案：一種檢測純黃絲衣霉菌(Byssochlamysfulva)的試劑，其特征在于它包括上游引物、下游引物和熒光探針；所述上游引物、下游引物和熒光探針序列如下：上游引物：5′-TTGGAAGGTCTATGAGATGAGGAAT-3′下游引物：5′-GCGGAGCGTCTTATTGCAAT-3′熒光探針：5′-TAM-CAACTTAGCTACAATGGCACCTCCGACCT-BHQ2-3′其中TAM為熒光報告基團，BHQ2為熒光淬滅基團。本專利技術的第二個目的是提供一種檢測純黃絲衣霉菌(Byssochlamysfulva)的實時熒光PCR試劑盒，通過根據純黃絲衣霉的Betatubulin的部分基因序列設計特定的引物和TaqMan熒光探針，實現實時熒光PCR檢測試劑盒的制備，并通過檢測試劑盒，能對純黃絲衣霉菌進行快速、準確、特異的檢測。為了實現上述目的，本專利技術采用如下技術方案：一種檢測純黃絲衣霉菌的實時熒光PCR試劑盒，包括：上游引物、下游引物、熒光探針、PCR緩沖溶液、dNTP、DNA聚合酶和MgCl2，其特征在于所述上游引物、下游引物和熒光探針序列如下：上游引物：5′-TTGGAAGGTCTATGAGATGAGGAAT-3′下游引物：5′-GCGGAGCGTCTTATTGCAAT-3′熒光探針：5′-TAM-CAACTTAGCTACAATGGCACCTCCGACCT-BHQ2-3′其中TAM為熒光報告基團，BHQ2為熒光淬滅基團。本專利技術的關鍵在于上游引物、下游引物和探針序列的設計及檢測方法，試劑盒中其他組成，可按本領域常規進行選擇，該試劑盒可用作純黃絲衣霉菌的定性檢測。本專利技術還提供了一種檢測純黃絲衣霉菌的實時熒光PCR方法，包括步驟：（1）提取待測樣品DNA，通常采用DNA提取試劑盒。（2）采用上述實時熒光PCR試劑盒，對樣本DNA和陰性對照樣品，進行目的基因的實時熒光PCR反應，并進行熒光檢測；（3）選擇TAM熒光檢測模式，基線調整取3～15個循環的熒光信號，以閾值線剛好超過正常陰性對照的最高點設定閾值線；若待測樣品熒光增長曲線超過閾值線，并呈良好的對數增長，Ct值小于35，則判斷為陽性。所述步驟（2）中的陰性對照品，可按本領域常規方法選擇，通常選擇不含靶基因的非靶菌，即選擇非純黃絲衣霉菌DNA樣本，如雪白絲衣霉菌、宛氏擬青霉菌等。所述步驟（3）中的Ct值為每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時所經歷的循環數。所述實時熒光PCR檢測體系終濃度組成如下：DNA模板，1～102ng/μL；PCR反應緩沖液，1×；上游引物，0.2～0.4μmol/L；下游引物，0.2～0.4μmol/L；探針，0.2～0.4μmol/L；dNTP，0.2～0.4mmol/L；DNA聚合酶，1～3U/反應；MgCl2，2.0～3.5mmol/L；ROX染料，0.05～0.8μmol/L；溶劑為無菌超純水。所述PCR緩沖溶液為10×PCR（Mg2+free）緩沖溶液，其反應體系中終濃度為1×，緩沖溶液的組成參見Takara公司的10×PCRBuffer（Mg2+free），Code：A6901A。所述PCR緩沖溶液在PCR反應體系中終濃度為1×。實際使用中，通常選用將DNA聚合酶、反應用Buffer、dNTP、Mg2+等試劑預混在一起的PremixType試劑（如TaqMan2×PCRMasterMix，AppliedBiosystems，K00062），進行實驗時，PCR反應液的配制簡單方便。所述PCR反應條件可為：95℃預變性3min；95℃變性15s，59℃退火40s，40個循環擴增。專利技術建立了利用TaqMan熒光PCR技術檢測純黃絲衣霉菌的方法，經檢測模擬果汁污染樣本，表明該方法切實可行。本專利技術的一種檢測純黃絲衣霉菌的試劑、實時熒光PCR試劑盒和檢測方法，具有快速、準確檢測，敏感性高，特異性好的特點；與常規PCR檢測技術相比，實時熒光PCR由于探針的應用和采用完全閉管檢測等，具有特異性大大提高、避免了交叉污染、降低常規PCR擴增的假陽性率、實時監測PCR擴增等優點。附圖說明圖1為實時熒光PCR的特異性檢測結果圖。圖2為實時熒光PCR的靈敏度檢測結果圖。純黃絲衣霉DNA濃度1-6依次為：7.2×101，7.2×100，7.2×10＿1，7.2×10＿2，7.2×10＿3，7.2×10＿4ng/μL。具體實施方式下面結合具體實施例對本專利技術進行進一步描述，但本專利技術的保護范圍并不僅限于此：實施例1：特異引物、熒光探針1、材料：PCR反應緩沖液（10×）（Mg2+free）、dNTP、DNA聚合酶、MgCl2均購自Takara公司；ROX染料購自上海位點生物科技有限公司。ABI7300實時熒光PCR儀為美國AppliedBiosystems公司產品。2、引物及探針設計與合成：以純黃絲衣霉菌Betatubulin基因序列為模板，使用PrimerExpressTM(V3.0，美國ABI公司)軟件分析引物和TaqMan探針位點，從中選擇最佳組合：上游引物：5′-TTGGAAGGTCTATGAGATGAGGAAT-3′下游引物：5′-GCGGAGCGTCTTATTGCAAT-3′熒光探針：5′-TAM-CAACTTAGCTACAATGGCACCTCCGACCT-BHQ2-3′其中TAM為熒光報告基團，BHQ2為熒光淬滅基團。均由上海英濰捷基生物技術有限公司合成。實施例2：純黃絲衣霉實時熒光PCR法靈敏度和特異性評價1、菌株檢測：用2株純黃絲衣霉標準株（ATCC24474、ATCC24008）、以及雪白絲衣霉（ATCC22260、ATCC18742）、費氏新薩托菌（ATCC66640、ATCC66641）、宛氏擬青霉（CICC4024、CICC4025）、黑曲霉（ATCC16404）、煙曲霉（ATCC10894）、釀酒酵母（ATCC26603）、宋內志賀菌（ATCC25931）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、副溶血性弧菌（本實驗室分離保存）、大腸埃希氏菌（ATCC25922）等非純黃絲衣霉菌菌懸液，提取DNA，然后用檢測用上下游引物及探針在美國AB本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種檢測純黃絲衣霉菌(Byssochlamys?fulva)的試劑，其特征在于它包括上游引物、下游引物和熒光探針；所述上游引物、下游引物和熒光探針序列如下：上游引物：5′?TTGGAAGGTCTATGAGATGAGGAAT?3′下游引物：5′?GCGGAGCGTCTTATTGCAAT?3′熒光探針：5′?TAM?CAACTTAGCTACAATGGCACCTCCGACCT?BHQ2?3′其中TAM為熒光報告基團，BHQ2為熒光淬滅基團。

【技術特征摘要】
1.一種檢測純黃絲衣霉菌(Byssochlamysfulva)的試劑，其特征在于它包括上游引物、下游引物和熒光探針；所述上游引物、下游引物和熒光探針序列如下：上游引物：5′-TTGGAAGGTCTATGAGATGAGGAAT-3′下游引物：5′-GCGGAGCGTCTTATTGCAAT-3′熒光探針：5′-TAM-CAACTTAGCTACAATGGCACCTCCGACCT-BHQ2-3′其中TAM為熒光報告基團，BHQ2為熒光淬滅基團。2.一種檢測純黃絲衣霉菌(Byssochlamysfulva)的實時熒光PCR試劑盒，所述試劑盒主要包括上游引物、下游引物、熒光探針、PCR緩沖溶液、dNTP、DNA聚合酶和MgCl2，其特征在于所述上游引物、下游引物和熒光探針序列如下：上游引物：5′-TTGGAAGGTCTATGAGATGAGGAAT-3′下游引物：5′-GCGGAGCGTCTTATTGCAAT-3′熒光探針：5′-TAM-CAACTTAGCTACAATGGCACCTCCGACCT-BHQ2-3′其中TAM為熒光報告基團，BHQ2為熒光淬滅基團。3.一種檢測純黃絲衣霉菌的實時熒光PCR方法，其特征在于，包括步驟：（1）提取待測樣品DNA；（2）采用如權利要求2所述的實時熒光P...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張慧，姜侃，汪新，陳小珍，
申請(專利權)人：浙江省質量檢測科學研究院，
類型：發明
國別省市：浙江;33