一種基于無標記適體傳感器的OTA化學發光檢測方法技術

本發明專利技術提供了一種基于無標記適體傳感器的OTA化學發光檢測方法，該技術方案首先將適體捕獲探針固定在磁性微球表面，然后利用捕獲探針與OTA分別結合OTA適體的競爭關系，基于適體的特異性結合能力強于互補鏈的結合力，得到磁性微球表面檢測探針的量與待測OTA濃度的量化關系；最后，對適體傳感器進行化學發光檢測。其化學發光檢測機制基于OTA適體鏈上的鳥嘌呤堿基(G)與化學發光試劑苯甲酰甲醛(PG)間的瞬時衍生化反應產生化學發光的原理實現的，從而省去了其他化學放光標記物的標記環節，在保證靈敏度的基礎上簡化了操作步驟，縮短了檢測時間，再加之所用化學發光分析法線性范圍寬、設備簡單、易操作，因此有望實現全自動化檢測。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及分析化學
，進一步涉及核酸適配體技術，具體涉及一種基于無標記適體傳感器的OTA化學發光檢測方法。
技術介紹
赭曲霉毒素A(ochratoxinA,OTA)是一種具有很強毒性的真菌毒素，其毒性在真菌毒素家族中位列第二位，僅次于黃曲霉毒素。OTA在自然界分布廣泛，不僅污染谷物糧食，還嚴重污染動物性食品，對人類構成極大的威脅。鑒于食品安全問題關乎整個社會的安危，是受到國家及人民高度關注的大問題，建立OTA的高靈敏簡便快速分析方法越發受到科研人員的重視。目前，很多基層食品檢測部門較多采用薄層層析法進行OTA的定量檢測，這也是較早的一種OTA的檢測方法，但其存在靈敏度較差、檢測周期長、所需試劑較多、重現性差等缺點，已然不能滿足現階段對OTA的檢測要求。另外，常見的OTA檢測方法還有高效液相色譜-熒光檢測法、毛細管電泳-二極管陣列檢測法、液相-質譜聯用法、固相萃取熒光檢測法等，但這些方法通常對樣品中毒素純度做了較高要求，且所使用的相關設備價格昂貴，故存在檢測周期長、成本高等一些缺點，導致無法滿足大批量樣本快速篩查的需要。另外，OTA作為一種小分子物質，其分子量為403.82，是典型的半抗原，故有基于OTA免疫抗體分子作為識別元件的免疫檢測方法，例如免疫傳感、酶聯免疫法等。這些方法雖然靈敏度高、特異性好，但也存在一定的局限性，比如抗體分子制備周期長、成本較高、穩定性差、易失活及易受pH、溫度等環境因素影響而變性，故在不同程度上限制了免疫方法檢測OTA的開展。近年來，核酸適配體技術在分析化學尤其是微量物質的定量檢測中展現出了突出的技術優勢。核酸適配體是通過SELEX技術體外篩選出來的能夠特異性結合目標配體的寡聚核苷酸片段。以其特有的高親和力和特異性，可作為識別探針和生物傳感器，與蛋白質類抗體相比，核酸適體不僅能高效、特異性地識別和結合各種生物目標分子，還具有易標記、易合成、性質穩定等優勢。然而，要獲得可行的檢測方法，建立高效的適配體傳感器是關鍵所在，首先適體傳感器在分子水平上應當滿足實驗所選擇的發光體系的要求，采用何種標記物，標記物在傳感器上的連接方法等都需要進行針對性設計；此外，選擇何種分離載體和捕獲探針可以完整收集信號物質并實現與信號物質含量成規律的發光反應，也需要根據發光體系、標記物、適配體等物質的性質進行設計；除此之外，發光體系的選擇關乎最終檢測結果與被檢測物質真實含量之間的關系，因此也是影響檢測效果的重要因素。
技術實現思路
本專利技術旨在針對現有技術的技術缺陷，提供一種基于無標記適體傳感器的OTA化學發光檢測方法，以解決現有技術中OTA檢測方法靈敏性差、結果不穩定的技術缺陷。本專利技術要解決的另一技術問題是現有技術中基于適體技術的OTA化學發光檢測方法，普遍需要附加標記物以提升發光靈敏性，從而導致檢測步驟繁瑣的技術。本專利技術要解決的再一技術問題是現有技術中基于適體技術的OTA化學發光檢測方法耗時較長。為實現以上技術目的，本專利技術采用以下技術方案：一種基于無標記適體傳感器的OTA化學發光檢測方法，包括以下步驟：1)通過氨羧反應將氨基修飾的捕獲探針固定在羧基磁性微球表面，得到磁性微球-捕獲探針復合物；2)取待測樣品與過量的OTA適體混合，充分反應；3)向步驟2)所得產物中加入過量的磁性微球-捕獲探針復合物捕獲游離的OTA適體，反應后取固相，即得到OTA適體傳感器；4)將步驟3)所述OTA適體傳感器與PG溶液混勻，而后檢測發光信號CL值。作為優選，步驟1)包括以下操作：取磁性微球，利用0.05～0.2M的咪唑緩沖溶液洗滌，而后取固相重懸于含有EDC的咪唑緩沖溶液中，于35～39℃震蕩孵育15～25min，而后以磁性微球與氨基修飾的捕獲探針用量比為3:(1～2)(μg:pmol)的比例加入氨基修飾的捕獲探針，于35～39℃震蕩反應50～70min。作為優選，步驟1)還包括以下操作：于35～39℃震蕩反應50～70min后，取固相利用PBST緩沖溶液洗滌。在該優選技術方案中，利用PBST緩沖溶液洗滌，旨在洗去多余的未固定到磁性微球表面的捕獲探針，洗滌次數可以優選為3次。作為優選，步驟1)還包括以下操作：利用PBST緩沖溶液洗滌后，取固相加入8～12％的PVP溶液，于35～39℃條件下震蕩50～70min。在此優選技術方案中，將固相(磁性微球)與PVP溶液混合，旨在以PVP溶液為封閉液，封閉磁性微球表面多余的結合位點，從而減少后續反應中的非特異性吸附。作為優選，步驟1)還包括以下操作：于35～39℃條件下震蕩50～70min后取固相利用PBST緩沖溶液洗滌，而后取固相重懸于BA緩沖溶液中，即得到磁性微球-捕獲探針復合物；其中所述BA緩沖溶液是含有：20mMTris，0.5MNaCl的水溶液，其pH是7.8～8.2。作為優選，步驟2)包括以下操作：取OTA適體，于85～95℃水浴5～10min，而后于2～6℃水浴8～12min，而后將過量的OTA適體與待測樣品在BB適配體反應液中混合，于35～39℃條件下震蕩反應55～65min。在此優選技術方案中，對OTA適體先熱水浴再冷水浴的前處理方法有助于提升步驟3)中OTA適體與捕獲探針的雜交效率。作為優選，步驟3)中反應條件為35～39℃震蕩55～65min。該步驟用于使上一步反應后多余OTA適體與捕獲探針互補雜交，從而固定到磁性微球表面。作為優選，步驟3)取固相后利用PBST緩沖溶液洗滌，而后取固相重懸于四丁基磷酸鹽緩沖溶液中，即得到OTA適體傳感器。作為優選，步驟4)所述PG溶液是以PG為溶質、以DMF為溶劑的溶液，其中PG的用量與步驟1)中磁性微球用量的比值為(2～3):3(mmoL:μL)。作為優選，以上技術方案中所述的取固相，均是通過磁性分離移去上清液實現的。作為優選，所述檢測發光信號CL值，是利用BPCL微弱化學發光儀實現的。在以上技術方案中，所述PBST緩沖溶液可以是含有137mMNaCl，2.7mMKCl，10mMNa2HPO4·12H2O，2mMKH2PO4，0.05％Tween20的水溶液，其pH是7.2～7.6。所述BB適配體反應液可以是含有10mMTris，0.12MNaCl，0.005MKCl，0.02MCaCl2的水溶液，其pH是8.2～8.8。所述四丁基磷酸鹽緩沖溶液可以是含有0.1M四丁基氫氧化銨的磷酸緩沖液。所述BA緩沖溶液可以是含有20mMTris，0.5MNaCl的水溶液，其pH是7.8～8.2。在以上技術方案中，所述氨基修飾的捕獲探針是序列如下所示的核酸-氨基酸復合物：5’-CACCCACACCCIATCAAAAAAAAAA-NH2-3’；該物質可自試劑銷售公司定制、購得。所述OTA適體是序列如下所示的DNA片段：5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3’，亦可自市面購得。所述過量的OTA適體，是指OTA適體與OTA的特異性結合反應中，OTA適體的量較多、使結合反應完成后仍有未結合OTA適體游離于體系中的情形；具體的OTA適體用量可根據對待測樣品中OTA含量的估算來確定，當然亦可參照本專利技術實施例中OTA適體用量來實施本專利技術。所述充分反應是指OTA適體與OTA的特異性結合完全。所述本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種基于無標記適體傳感器的OTA化學發光檢測方法，其特征在于包括以下步驟：1)通過氨羧反應將氨基修飾的捕獲探針固定在羧基磁性微球表面，得到磁性微球?捕獲探針復合物；2)取待測樣品與過量的OTA適體混合，充分反應；3)向步驟2)所得產物中加入過量的磁性微球?捕獲探針復合物捕獲游離的OTA適體，反應后取固相，即得到OTA適體傳感器；4)將步驟3)所述OTA適體傳感器與PG溶液混勻，而后檢測發光信號CL值。

【技術特征摘要】
1.一種基于無標記適體傳感器的OTA化學發光檢測方法，其特征在于包括以下步驟：1)通過氨羧反應將氨基修飾的捕獲探針固定在羧基磁性微球表面，得到磁性微球-捕獲探針復合物；2)取待測樣品與過量的OTA適體混合，充分反應；3)向步驟2)所得產物中加入過量的磁性微球-捕獲探針復合物捕獲游離的OTA適體，反應后取固相，即得到OTA適體傳感器；4)將步驟3)所述OTA適體傳感器與PG溶液混勻，而后檢測發光信號CL值。2.根據權利要求1所述的一種基于無標記適體傳感器的OTA化學發光檢測方法，其特征在于步驟1)包括以下操作：取磁性微球，利用0.05～0.2M的咪唑緩沖溶液洗滌，而后取固相重懸于含有EDC的咪唑緩沖溶液中，于35～39℃震蕩孵育15～25min，而后以磁性微球與氨基修飾的捕獲探針用量比為3:(1～2)(μg:pmol)的比例加入氨基修飾的捕獲探針，于35～39℃震蕩反應50～70min。3.根據權利要求2所述的一種基于無標記適體傳感器的OTA化學發光檢測方法，其特征在于步驟1)還包括以下操作：于35～39℃震蕩反應50～70min后，取固相利用PBST緩沖溶液洗滌。4.根據權利要求3所述的一種基于無標記適體傳感器的OTA化學發光檢測方法，其特征在于步驟1)還包括以下操作：利用PBST緩沖溶液洗滌后，取固相加入8～12％的PVP溶液，于35～39℃條件下震蕩50～70min。5.根據權利要求4所述...

【專利技術屬性】
技術研發人員：嚴喜鸞，劉杰，肖義陂，
申請(專利權)人：南昌大學，
類型：發明
國別省市：江西;36