用于定量檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑S的試劑盒制造技術

本發明專利技術提供了一種用于定量檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑S的試劑盒，其包括偶聯有鏈霉親和素的磁性微粒、生物素標記的半胱氨酸蛋白酶抑制劑S第一單克隆抗體、酶標記的半胱氨酸蛋白酶抑制劑S第二單克隆抗體、半胱氨酸蛋白酶抑制劑S校準品。該試劑盒可用于精確測定生物樣品中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑S。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物檢測領域，具體地說，涉及一種用于定量檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑S的試劑盒、尤其是通過磁微粒化學發光法定量檢測人半胱氨酸蛋白酶抑制劑S的試劑盒。
技術介紹
《2015年中國腫瘤登記年報》權威數據顯示，2015年中國腫瘤發病數為4249，000例，平均每天就有12000例新診斷的腫瘤患者，而腸癌、胃癌均是發病率最高的五大腫瘤之一。世界衛生組織(WHO)指出，防治癌癥關鍵是“早發現、早診斷、早治療”。因此，采用有效的方法實現癌癥的早期診斷、療效評估及術后監測對于降低癌癥整體死亡率、提高患者生存期起重大作用。目前，胃腸鏡篩查技術、免疫組化切片試驗、大便隱血試驗、血液CEA指標是醫院很常規的檢測項目。雖然通過胃腸鏡篩查技術、大便隱血試驗、血液CEA指標可早期發現腸癌、胃癌，且通過早期治療，5年生存率提高90％以上，然而這些方法均有不足之處：胃腸鏡篩查及免疫組化切片試驗是侵入性的，檢查痛苦，有出血、穿孔等風險性；大便隱血試驗，不易被民眾接受；CEA指標，靈敏度低，特異性不高。胃癌、腸癌的防治仍存在大量亟待解決的問題，包括如何在更早期發現并及時干預，如何實現療效評估和監測，如何對術后患者做到實時準確的復發監控。半胱氨酸蛋白酶抑制劑S，簡稱為胱抑素S，英文名CystatinS，是人類Cystatin家族成員，由CST4基因編碼，含141個氨基酸，分子中有兩個二硫鍵分子量為16.4Kda，為典型的分泌蛋白，分布于多種體液和分泌物中，如眼淚、唾液、血清、血漿等。CystatinS最早由上海良潤生物醫藥科技有限公司發現，其在胃腸癌組織中具有高水平的表達，而在胃腸道正常組織中低表達。胃癌、腸癌患者的血清中CystatinS的表達量也明顯高于正常人血清。表達水平與腫瘤的病變、分化情況呈正相關，這說明其可能在胃腸癌的發生、發展過程中扮演重要角色，因此CystatinS是可以作為診斷和預示胃腸癌的標志物，也是我國擁具有自主知識產權的新型胃腸癌腫瘤標志物，參見CN103901205A、CN103901196A、CN103901207A、CN103913574A、CN103913575A、CN103911426A、CN103926409A、CN104558116A。此外，上海良潤生物醫藥科技有限公司還獲得了一對分泌針對人CystatinS抗原決定簇的特異性抗體5D2F2和5E4G5的雜交瘤細胞，保藏于武漢大學中國典型培養物保藏中心，保藏號分別為CCTCCNO：C201416和CCTCCNO：C201415。目前，用于人CystatinS的免疫分析方法只有酶聯免疫分析法。酶聯免疫法是腫瘤標志物常用的免疫分析方法之一，它具有試劑和儀器成本低、操作的簡單優點，但同時存在著靈敏度低、反應時間長、操作步驟繁鎖且不易實現全自動化等缺點。隨著標記免疫技術的迅速發展，各種新的檢測方法不斷問世。化學發光免疫分析法是在酶聯免疫分析基礎上發展起來的更敏感的微量免疫檢測技術，然而在實際的免疫檢測中，由于待測樣品中所含的雜質成分較多，一定程度上影響了檢測的靈敏度和準確度。迄今為止，人半胱氨酸蛋白酶抑制劑S的臨床檢測中缺乏一種操作過程簡單、反應時間短、檢測限低、靈敏度高、特異性好、穩定性好的診斷試劑盒。
技術實現思路
為了克服現有的人半胱氨酸蛋白酶抑制劑S檢測技術的上述缺陷，本專利技術基于磁微粒化學發光法，設計了一種全新的試劑盒，能夠對生物樣品中半胱氨酸蛋白酶抑制劑S的含量進行精確測量，從而為胃癌、腸癌的早期診斷提供可靠依據。因此，本專利技術提供了一種用于定量檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑S的試劑盒，其包括：偶聯有鏈霉親和素的磁性微粒；生物素標記的半胱氨酸蛋白酶抑制劑S第一單克隆抗體；酶標記的半胱氨酸蛋白酶抑制劑S第二單克隆抗體；半胱氨酸蛋白酶抑制劑S校準品和/或半胱氨酸蛋白酶抑制劑S質控品。在一種實施方式中，上述試劑盒中，所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑S第一單克隆抗體和所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑S第二單克隆抗體不同，兩者之一是單克隆抗體5D2F2或者單克隆抗體5E4G5，其中單克隆抗體5D2F2是保藏號為CCTCCNO：C201416的雜交瘤細胞分泌的人CystatinS特異性單克隆抗體；單克隆抗體5E4G5是保藏號為CCTCCNO：C201415的雜交瘤細胞分泌的人CystatinS特異性單克隆抗體。在一種優選的實施方式中，上述試劑盒中的所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑S第一單克隆抗體與所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑S第二單克隆抗體不同，分別選自半胱氨酸蛋白酶抑制劑S單克隆抗體5D2F2和半胱氨酸蛋白酶抑制劑S單克隆抗體5E4G5。單克隆抗體5D2F2和單克隆抗體5E4G5的效價達1：107以上，親和力達10-9Ka以上。在一種實施方式中，上述試劑盒中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑S校準品和半胱氨酸蛋白酶抑制劑S質控品是真核細胞表達的重組半胱氨酸蛋白酶抑制劑S蛋白或大腸桿菌表達的重組半胱氨酸蛋白酶抑制劑S蛋白。比如CystatinS校準品或CystatinS質控品可以為通過將重組質粒轉染到真核細胞，培養后收集陽性細胞上清，分離出真核表達的CystatinS蛋白；也可以為通過基因工程的手段及大腸桿菌表達系統獲得的原核CystatinS蛋白。CystatinS校準品可用于制作標準曲線，從而使得CystatinS檢測定量化。在一種優選的實施方式中，上述磁性微粒的粒徑是0.1-10微米、優選0.2-5微米、優選0.2-3微米、更優選0.3-2微米、更優選0.5-1微米，以便在試劑盒使用時的檢測體系形成接近均相的反應體系。在一種優選的實施方式中，所述磁性微粒是表面帶有活性基團、以四氧化三鐵為內核的聚合物。所述活性基團可以是氨基、羧基、IDA(亞氨基二乙酸)、環氧基等，優選氨基或羧基。在一種優選的實施方式中，上述試劑盒中的偶聯有鏈霉親和素的磁性微粒呈磁珠懸液形式，即鏈霉親和素磁珠懸液作為磁分離試劑。本專利技術的試劑盒中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑S檢測體系采用酶催化的底物化學發光法，從而通過進行光電信號檢測而確定樣品中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑S含量。在一種實施方式中，上述試劑盒中的酶優選是過氧化物酶、堿性磷酸酶、磷酸酯酶或熒光素酶，更優選辣根過氧化物酶(Horseradishperoxidase，簡稱HRP)或者堿性磷酸酶，更優選辣根過氧化物酶。作為辣根過氧化物酶的作用底物，可以選自下組：氨基苯二酰一肼(魯米諾)、異氨基苯二酰一肼、氨基丁基乙基異氨基苯二酰一肼(ABEI)、氨基己基乙基異氨基苯二酰一肼(AHEI)、7-二甲基氨基萘-l,2-二羧酸酰肼、環取代的氨基鄰苯二甲酰肼、蒽-2,3-二羧酸酰肼、菲-1,2-二羧酸酰肼、芘二羧酸酰肼、5-羥基-鄰苯二甲酰肼、6-羥基鄰苯二甲酰肼、2,3-二氮雜萘二酮類似物、9,10-二氫化吖啶類化合物比如9,10-二氫化吖啶酯、9,10-二氫化吖啶酯、9,10-二氫化吖啶硫酯、9,10-二氫化吖啶磺酰胺、9,10-二氫化吖啶二硫縮烯酮化合物。優選是魯米諾。酶的作用底物可以單獨作為試劑盒的組成部分，即，底物溶液。優選地，所述底物溶液含有魯米諾。相對應地，上述試劑盒進一步包含引發劑溶液，該引發劑溶液包含過氧化氫，比如是雙氧水溶液。在一種優選的實施方式中，上述試劑盒用本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于定量檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑S的試劑盒，其包括：偶聯有鏈霉親和素的磁性微粒；生物素標記的半胱氨酸蛋白酶抑制劑S第一單克隆抗體；酶標記的半胱氨酸蛋白酶抑制劑S第二單克隆抗體；半胱氨酸蛋白酶抑制劑S校準品。

【技術特征摘要】
1.一種用于定量檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑S的試劑盒，其包括：偶聯有鏈霉親和素的磁性微粒；生物素標記的半胱氨酸蛋白酶抑制劑S第一單克隆抗體；酶標記的半胱氨酸蛋白酶抑制劑S第二單克隆抗體；半胱氨酸蛋白酶抑制劑S校準品。2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑S第一單克隆抗體和所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑S第二單克隆抗體不同，兩者之一是單克隆抗體5D2F2或者單克隆抗體5E4G5，其中單克隆抗體5D2F2是保藏號為CCTCCNO：C201416的雜交瘤細胞分泌的人CystatinS特異性單克隆抗體；單克隆抗體5E4G5是保藏號為CCTCCNO：C201415的雜交瘤細胞分泌的人CystatinS特異性單克隆抗體。3.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑S第一單克隆抗體與所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑S第二單克隆抗體不同，分別選自單克隆抗體5D2F2...

【專利技術屬性】
技術研發人員：周小進，周小偉，何林富，王義，
申請(專利權)人：上海良潤生物醫藥科技有限公司，
類型：發明
國別省市：上海;31