本發明專利技術涉及一種檢測農藥阿特拉津殘留的量熱仿生競爭檢測方法，屬于生物傳感器領域，用于快速檢測食品或水源樣品中的農藥阿特拉津殘留，將S-MIP作為識別元件填充于反應柱。將待測樣品經簡單前處理后在流動相下與一定量的β-內酰胺酶標記的待測物競爭結合S-MIP上的印跡位點。加入酶特異性底物釋放的熱信號與待測物含量呈反比。在優化實驗條件的基礎上建立標準曲線。“放大法”特異、定量檢測典型農藥阿特拉津的量熱仿生傳感方法，具有樣品前處理簡便、靈敏度高、特異性強、定量檢測的優點。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種檢測農藥阿特拉津殘留的量熱仿生競爭檢測方法，屬于生物傳感器領域，用于快速檢測食品或水源樣品中的農藥阿特拉津殘留，具有樣品前處理簡便、靈敏度高、特異性強、定量檢測的優點。
技術介紹
除草劑阿特拉津(Atrazine，ATR)又名莠去津，全稱為2-氯-4-乙胺-6-異丙胺-1，3，5-三嗪，分子量為215.69三嗪類除草劑作為選擇性內吸傳導型苗前、苗后除草劑，通過抑制光合作用達到去除雜草的目的，自上世紀50年代開發生產以來得到了大面積使用，主要用于玉米、高粱、甘蔗、果樹、林地等旱田，其中以阿特拉津(ATR)使用最為廣泛；ATR具有一定殘留毒性，可抑制水體中多種藻類的光合作用，使魚的生理功能發生紊亂、殺死水底節肢動物，嚴重時可致使小鼠的染色體受損。在低濃度長期暴露下，ATR會使人體的內分泌系統及生殖系統紊亂，具有潛在的致癌作用。鑒于此，許多國家對水體中ATR殘留限量做出了明確規定：美國環境保護局規定ATR在水中的最高允許濃度為3μg/L，歐盟規定飲用水中ATR含量不得超過0.1μg/L，我國國家環保部規定地表水(1-2類)中ATR的最高允許濃度為3μg/L。ATR殘留引起的環境污染及健康危害問題已引起人們的廣泛關注。因此，在實踐工作中迫切需要建立ATR殘留的快速檢測方法。對ATR實現準確分析的常用方法有GC-MS、HPLC-MS以及傳感器檢測等。這些檢測方法主要是通過對樣品的光、電學信號的改變來實現檢測，因而對樣品前處理要求高，程序繁瑣，消耗時間長，并且儀器設備昂貴、需要專業的操作人員，極大的限制了快速檢測方法的建立。免疫學檢測方法具有方法快速、簡便、靈敏高、特異性強、設備便攜等優點使其適合于快速檢測，在檢測基質成分單一的樣品時具有良好的效果，但面對復雜基質樣品時，檢測信號常受到基質光學特性嚴重干擾，另外，農藥殘留物濃縮富集過程中應用的有機溶劑會使抗體的活性下降甚至喪失，會干擾后續抗原抗體的免疫反應，極大限制了免疫學方法快速檢測小分子殘留的應用。量熱傳感器是對生物反應中伴隨的吸熱或產熱信號進行檢測。其共性之一就是通過固定化酶對特異性底物的催化反應中熱焓的變化而實現檢測。該檢測技術具有良好的通用性及檢測穩定性。與其它分析方法相比較具有諸多優勢，如：可對大多數生物樣品進行分析、固定化酶可重復使用、檢測不受樣品光、電學環境特性的干擾，可實現連續流動相下檢測、檢測過程簡便、可引入參比部件等。由于熱量傳感元件無需與流動相直接接觸，因而消除了傳感器漂移現象。量熱傳感器最先用于對葡萄糖及尿素的檢測，然后逐漸應用于臨床醫學、環境監測、食品衛生、工業過程監測等領域。由于檢測熱信號反應總的放熱量，因而檢測缺乏特異性是該類檢測方法的不足。對于由載液與樣品在pH及離子強度上的不匹配造成的非特異性信號響應可以通過對樣品稀釋或引入參比柱進行信號差異性檢測加以克服。量熱檢測方法中熱信號以峰的形式出現，峰高正比于放熱量，峰面積及峰上升斜率與底物濃度呈線性關系。量熱生物檢測(TELISA)是基于酶聯免疫吸附檢測基本原理結合量熱儀檢測熱信號的方法。Scheper等人利用夾心法建立了一種簡單的TELISA方法用以檢測各種IgG。郄志偉等利用直接競爭法原理首次建立了一種用于快速檢測玉米秸稈中典型三嗪類農藥-阿特拉津殘留的TELISA方法，成功實現了量熱法對農藥殘留的檢測。其中，量熱傳感器反應柱內固相載體所填充的表面印跡材料先后使用了CPG微球、蛋白G等材料，取得了較好的效果。分子印跡材料含有大量印跡孔穴的分子印跡聚合物(MIPS)是人工合成受體，它具有類似天然抗體或酶的特異性和選擇性，這種含有合成識別元件的仿生傳感器可以在各種惡劣的環境中使用。MIPS包含大量的印跡孔穴，這些孔穴能夠通過形狀、大小和官能團(如氫鍵)與靶分子進行互補，它特別適用于小分子的檢測。
技術實現思路
本專利技術的第一個目的是提供一種量熱傳感器反應柱內固相載體所填充的表面印跡材料，其特征是通過表面印跡技術(s-MIT)在氨基化修飾的可控有孔玻璃珠(CPG)表面印跡的針對阿特拉津的特異性印跡層產物(s-MIP)。本專利技術的第二個目的是提供一種檢測農藥阿特拉津殘留的量熱仿生競爭檢測方法方法。本專利技術的技術方案概述如下：本專利技術將S-MIP作為識別元件填充于反應柱。將待測樣品經簡單前處理后在流動相下與一定量的β-內酰胺酶標記的待測物競爭結合S-MIP上的印跡位點。加入酶特異性底物釋放的熱信號與待測物含量呈反比。在優化實驗條件的基礎上建立標準曲線，最終建立樣品前處理簡便、“放大法”特異、定量檢測典型農藥阿特拉津的量熱仿生傳感方法，具體步驟如下：1.S-MIP的制備(1)將2.85g阿特拉津溶于100mlN，N-二甲基甲酰胺(DMF)乙酸緩沖液混合溶液(DMF∶乙酸緩沖液＝9∶1，v/v；乙酸緩沖液，0.2mol/L，pH5.8)。在機械攪拌的條件下使其完全溶解；(2)依次將5.635ml甲基丙烯酸(MAA)、1.46g亞甲基雙丙烯酰胺(BIS)及400mg可控有空玻璃珠(CPG)加入步驟(1)的混合溶液中，形成印跡預聚合體系；(3)38℃水浴，攪拌子轉速300rpm條件下體系預聚合12h；(4)預聚合體系通入氮氣30min，加入過硫酸銨(APS)引發接枝印跡聚合，反應10h；(5)經砂芯漏斗通過真空抽濾將印跡產物從體系分離；(6)用50％甲醇水溶液，pH8～9，含1mol/LNaCl的再生液37℃條件下對產物再生24h，期間每8h更新再生液1次。制備得到的產物用乙醇沖洗后在真空干燥箱烘干備用。同時對所得產物進行掃描電鏡表征(SEM)鑒定，結果如圖1所示。從SEM表征圖可見，CPG表面形成明顯的印跡層。方法中功能單體甲基丙烯酸(MAA)與交聯劑亞甲基雙丙烯酰胺(BIS)摩爾比為7∶1；功能單體對-苯乙烯磺酸鈉(SSS)與模板分子阿特拉津(ATR)摩爾比為5∶12.MIP量熱法檢測阿特拉津：MIP量熱檢測裝置如圖2所示：(1)將表面印跡產物裝入反應器置于熱調節器中，通入經0.22μm針式濾器過濾及超聲除氣的載液(0.02molL-1，pH5.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液，含2％DMF)平衡流動體系，體系流速1000μlmin-1；(2)用載液為溶劑配制0-20ngmL-1梯度濃度的阿特拉津溶液，與一定量β-內酰胺酶標記的阿特拉津混合制備成樣品。(3)經0.22μm針式濾器過濾后，加入樣品溶液。待測物與酶標待測物在流動相下競爭結合S-MIP表面的印跡孔穴。多余的樣品隨流動相沖洗出反應柱。(4)加入特異性底物——氨芐西林所產生的熱信號變化被惠斯通電橋收集、轉化后在量熱工作站(N2000色譜數據工作站)上以峰信號顯示；(5)從加入樣品到酶促反應熱信號產生完全可在10min內完成，加上本底信號值檢測、再生后基線恢復，一個樣品完整的檢測時間不超過30min。檢測原理如圖3所示：3.量熱法檢測阿特拉津方法的建立3.1實驗條件的優化本實驗中選用表面印跡材料作為固相載體及識別元件，是因為：1、在量熱方法中最常用到的孔性固相載體CPG表面進行印跡利于控制印跡產物的粒徑及孔徑控制，使印跡產物在流動相下不產生太高的背景壓力；2、CPG微球上進行表面印跡可以本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種檢測農藥阿特拉津殘留的量熱仿生競爭檢測方法，其特征是量熱傳感器反應柱內固相載體所填充的表面印跡材料為通過以甲基丙烯酸為功能單體的表面印跡技術在氨基化修飾的可控有孔玻璃珠(CPG)表面印跡的針對阿特拉津的特異性印跡層產物(s?MIP)。
【技術特征摘要】
1.一種檢測農藥阿特拉津殘留的量熱仿生競爭檢測方法，其特征是量熱傳感器反應柱內固相載體所填充的表面印跡材料為通過以甲基丙烯酸為功能單體的表面印跡技術在氨基化修飾的可控有孔玻璃珠(CPG)表面印跡的針對阿特拉津的特異性印跡層產物(s-MIP)。2.一種檢測農藥阿特拉津殘留的量...
【專利技術屬性】
技術研發人員：高志賢，郄志偉，孫思明，寧保安，彭媛，白家磊，
申請(專利權)人：中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所，
類型：發明
國別省市：天津;12
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