一種抗VEGF類單克隆抗體的純化方法技術

本發明專利技術涉及蛋白質純化領域，具體涉及一種抗VEGF類單克隆抗體的純化方法。包括首先用復合材料層析進行捕獲，使抗體與收獲液中的大多數組分分離，繼而用羥基磷灰石層析進行精細純化，進一步去除宿主細胞污染物和聚集體等，所述的復合層析材料為離子交換作用和疏水作用的復合介質。本發明專利技術的技術方案，同時降低宿主蛋白(HCP)、DNA、多聚體、酸性峰的含量，從而達到顯著提高抗體純度的目的，且操作簡單，成本較低。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及蛋白質純化，具體涉及一種抗VEGF類單克隆抗體的純化方法。
技術介紹
貝伐珠單抗(Bevacizumab，商品名Avastin)是重組的人源化單克隆抗體。2004年2月26日獲得FDA的批準，是美國第一個獲得批準上市的抑制腫瘤血管生成的藥。通過體內、體外檢測系統證實IgG1抗體能與人血管內皮生長因子(VEGF)結合并阻斷其生物活性。貝伐珠單抗是通過中國倉鼠卵巢細胞(ChineseHamsterOvary，CHO)表達系統發酵培養生產的，一旦獲得感興趣的單抗澄清發酵液，通常使用不同層析技術的組合來試圖將目的蛋白與細胞生成的其它蛋白質分開。傳統的純化工藝通過三步層析得到單克隆抗體，如中國專利CN95192680.2，抗體純化公開的純化順序依次為ProteinA親和層析，離子交換層析以及疏水層析。ProteinA柱由于選擇性高和去雜質能力強，是親和層析的首選，但其價格昂貴、洗脫的低pH易導致高分子聚合物形成、ProteinA配基掉落等缺點，使越來越多的研究開始關注用非ProteinA工藝來解決現有問題。另外，三步工藝的回收率低、經濟成本高以及疏水層析所用到高鹽有使蛋白失出活性的風險，人們開始關注使用更高效率的兩步層析來純化單克隆抗體。貝伐珠單抗原研單位基因泰克公司申請的專利CN200880119331.X，通過陽離子交換層析進行的抗體純化，陽離子層析作為第一步層析，最大的瓶頸在于樣品的調節，需要調節樣品的pH值與電導率，調節樣品一方面增大了樣品的體積導致儲液罐和上樣時間都要增大，另一方面調節過程中往往會產生沉淀從而造成樣品的損失，因為樣品中含有大量的宿主蛋白(hostcellprotein，HCP)，pH調節過程中經過HCP的等電點從而造成了沉淀。同時陽離子的載量往往低于親和層析，導致成本的增加。歐州專利EP1651665采用了MEP捕獲純化非抗體蛋白以及類似于抗體的片段，它用了二步洗脫，第一步洗脫中加入了35％丙二醇，第二步洗脫中加入了50％丙二醇，回收率85％，但其未對單克隆抗體進行優化，應用于單克隆抗體后，純度和收率都較低。
技術實現思路
本專利技術的目的是針對上述現有技術的缺陷，提出一種能夠同時有效去除多種污染物的抗VEGF類單抗的純化方法。該方法能夠同時降低宿主蛋白(HCP)、DNA、多聚體、酸性峰的含量，從而達到顯著提高抗體純度的目的，且操作簡單，成本較低。本專利技術的技術方案提供了一種抗VEGF類單克隆抗體的純化方法，包括以下步驟：1)運用復合材料層析對收獲液中的抗體進行捕獲，所述復合材料為同時具備離子交換作用和疏水作用的復合介質；2)運用羥基磷灰石層析進行精細純化。本專利技術首先用復合材料層析進行捕獲，使抗體與收獲液中的大多數組分分離，繼而用羥基磷灰石層析進行精細純化，進一步去除宿主細胞污染物和聚集體等。具體地，本專利技術的技術方案提供了一種抗VEGF類單克隆抗體的純化方法，包括以下步驟：第一步層析-捕獲：1)將抗VEGF類單抗組合物加載到復合層析材料上；2)用pH為7.0～7.4的第一清洗緩沖液清洗所述復合層析材料；3)用pH低于第一清洗緩沖液的第二清洗緩沖液清洗所述復合層析材料；4)用pH低于第二清洗緩沖液、含有乙醇的洗脫緩沖液洗脫；第二步層析-精細純化：5)將步聚4)洗脫得到的樣品調節電導率至1.4～2.0mS/cm，加載于羥基磷灰石層析材料上；6)用pH為7.0～7.5的第三清洗緩沖液清洗所述羥基磷灰石材料；7)用pH為7.5～8.0、含NaCl的洗脫緩沖液洗脫。根據本專利技術一些具體實施例，所述抗VEGF類單抗組合物pH為6.5～7.0；所述的復合層析材料為離子交換作用和疏水作用的復合介質，優選地為PALL公司生產的MEP復合填料。根據本專利技術一些具體實施例，所述的抗VEGF類單抗組合物是中國倉鼠卵巢細胞(CHO)發酵表達。根據本專利技術一些具體實施例，步驟3)中，第二清洗緩沖液的pH為5.5～5.8；在其中一些優選的實施方式中，第二清洗緩沖液的pH為5.8。在一些優選的實施方式中，所述第一清洗緩沖液和/或第二清洗緩沖液為50mMPBS。根據本專利技術一些具體實施例，步驟4)所述的洗脫緩沖液pH為4.4～4.6；在其中一些優選的實施方式中，步驟4)所述的洗脫緩沖液pH為4.6。根據本專利技術一些具體實施例，步驟4)所述的洗脫緩沖液中乙醇的體積含量為1.0％～1.5％。在本專利技術的技術方案中，洗脫緩沖液中加入乙醇的目的是改變溶液的極性，提高洗脫分辨率，理論上，能達到該效果的具有極性性質的添加劑，例如聚乙二醇都屬于等同的替代方案。在一些優選的實施方式中，步驟4)中所述的洗脫緩沖液為50mM醋酸-醋酸鈉緩沖液并含有150mM氯化鈉，優選地，電導率為17～19mS/cm。根據本專利技術一些具體實施例，步驟4)所述的洗脫緩沖液中還含有苯丁酸鈉及尿素；在一些優選的實施方式中，苯丁酸鈉及尿素含量分別為5～7mM和0.05～0.15M，優選地，苯丁酸鈉的含量為5mM、6mM、6.9mM、7mM；尿素含量為0.05M、0.1M、0.15M。目的是改變溶液的緩沖液環境，提高洗脫分辨率。在一些優選的實施方式中，所述第三清洗緩沖液和/或步驟7)中所述洗脫緩沖液為10mMPBS，pH為7.5。根據本專利技術一些具體實施例，步驟7)所述的洗脫緩沖液有含氯化納，氯化鈉的含量為0.2～0.4M。優選地氯化鈉的含量為0.25M。根據本專利技術一些具體實施例，步驟1)執行前還包括分離細胞和發酵液。所述的分離選自離心和過濾。術語定義本文中要純化的“組合物”包含感興趣的抗體和一種或多種污染物。所述組合物可以是“部分純化的”(即已經進行過一個或多個純化步驟)或者可以是自生成抗體的宿主細胞或生物體直接獲得的(例如所述組合物可以包含收獲的細胞培養液)。術語“污染物”指與期望的抗體產物不同的物質。污染物包括但不限于：宿主細胞物質，諸如宿主細胞蛋白(HCP)、DNA；期望抗體的變體、片段、聚集物或衍生物；細胞培養基成分。術語“清洗緩沖液”在本文中用于指在加載組合物之后且在洗脫感興趣蛋白質之前流過復合層析材料的緩沖液。清洗緩沖液可用于自復合層析材料清除一種或多種污染物，基本上不洗脫期望抗體產物。依照本文中專利技術的優選實施方案，使用“第一清洗緩沖液”、“第二清洗緩沖液”和“第三清洗緩沖液”。術語“洗脫緩沖液”用于自固相洗脫感興趣抗體。在本文中，包括自復合層析材料洗脫感興趣抗體的洗脫液50mM醋酸-醋酸鈉緩沖液，具有相對于第二清洗緩沖液更低pH，及自羥基磷灰石層析材料洗脫感興趣抗體的洗脫液洗脫緩沖液10mMPBS，優選地，洗脫緩沖液中含有一定濃度的氯化鈉，使得期望抗體產物自固相填料中洗脫。術語“PBS緩沖液”是磷酸緩沖鹽溶液(phosphatebuffersaline)一般作為溶劑，起溶解保護試劑的作用。它是生物化學研究中使用最為廣泛的一種緩沖液，主要成分為Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl，由于Na2HPO4和KH2PO4它們有二級解離，緩沖的pH值范圍很廣。術語“多聚體”(D/A)可以理解為相同抗體的非共價結合，由兩個以上的抗體結合而成的分子。所述抗體可以由單鏈抗體共價結合(例如二硫鍵)的均質或異質多條多肽構成。本專利技術的多聚體可溶于水溶液本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種抗VEGF類單克隆抗體的純化方法，包括以下步驟：1)運用復合材料層析對收獲液中的抗體進行捕獲，所述復合材料為同時具備離子交換作用和疏水作用的復合介質；2)運用羥基磷灰石層析進行精細純化。

【技術特征摘要】
1.一種抗VEGF類單克隆抗體的純化方法，包括以下步驟：1)運用復合材料層析對收獲液中的抗體進行捕獲，所述復合材料為同時具備離子交換作用和疏水作用的復合介質；2)運用羥基磷灰石層析進行精細純化。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步驟：第一步層析-捕獲：1)將抗VEGF類單抗組合物加載到復合層析材料上；2)用pH為7.0～7.4的第一清洗緩沖液清洗所述復合層析材料；3)用pH低于第一清洗緩沖液的第二清洗緩沖液清洗所述復合層析材料；4)用pH低于第二清洗緩沖液、含有乙醇的洗脫緩沖液洗脫；第二步層析-精細純化：5)將步聚4)洗脫得到的樣品調節電導率至1.4～2.0mS/cm，加載于羥基磷灰石層析材料上；6)用pH為7.0～7.5的第三清洗緩沖液清洗所述羥基磷灰石材料；7)用pH為7.5～8.0、含NaCl的洗脫緩沖液洗脫；所述復合材料為同時具備離子交換作用和疏水作用的復合介質。3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述抗VEGF類單抗組合物pH為6.5...

【專利技術屬性】
技術研發人員：楊輝，馬旭通，楊彬，林小鵲，李文佳，
申請(專利權)人：廣東東陽光藥業有限公司，
類型：發明
國別省市：廣東;44