一種高靈敏的無酶電化學(xué)免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種高靈敏的無酶電化學(xué)免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用研究。利用簡(jiǎn)單的水熱法合成由氮摻雜的石墨烯及核殼結(jié)構(gòu)的銀和二氧化鈰組成的復(fù)合納米催化劑，其對(duì)過氧化氫具有良好的電催化還原能力，將其標(biāo)記信號(hào)抗體，作為模擬酶信號(hào)標(biāo)簽，實(shí)現(xiàn)分析信號(hào)的放大；通過簡(jiǎn)單的水熱法在修飾有金納米粒子的氧化銦錫導(dǎo)電電極表面生長(zhǎng)三維放射狀的氧化鋅，其可以負(fù)載大量的捕獲抗體，進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度。本發(fā)明專利技術(shù)構(gòu)建的免疫傳感器表現(xiàn)出線性范圍寬、檢測(cè)限低、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性高等優(yōu)良性能，在臨床分析腫瘤標(biāo)志物方面具有良好的應(yīng)用前景。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及復(fù)合納米材料技術(shù)、電化學(xué)分析檢測(cè)技術(shù)及腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)
，更具體地說是一種基于復(fù)合納米材料的優(yōu)良類酶催化性能構(gòu)建的用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的高靈敏電化學(xué)免疫傳感器。
技術(shù)介紹
眾所周知，癌癥是人類的一大健康殺手，準(zhǔn)確地檢測(cè)人類血清和組織中的腫瘤標(biāo)志物對(duì)于癌癥的早期篩查和診斷具有重大的意義。近些年來，各種各樣的免疫分析方法已經(jīng)被發(fā)展并用于腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)。相比于電化學(xué)發(fā)光、熒光、光電化學(xué)、比色、表面等離子體共振等免疫分析方法，電化學(xué)免疫分析方法由于其靈敏度高、裝置簡(jiǎn)單、成本低、便攜等優(yōu)點(diǎn)被更廣泛應(yīng)用。在電化學(xué)免疫分析中，標(biāo)記有酶的生物探針被廣泛的使用。盡管這些酶標(biāo)記的免疫傳感器能夠達(dá)到一定的分析靈敏度，其仍舊存在一些缺陷。因?yàn)槊傅姆€(wěn)定性較差，其催化活性易受外界環(huán)境的影響。特別是在固定和儲(chǔ)存的過程中，強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫及不同極性的溶劑極易導(dǎo)致酶變性。另外酶的制備和純化成本較高，且費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。相比于酶標(biāo)記的免疫傳感器，無酶的免疫傳感器具有成本低、穩(wěn)定性好及操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。因此，發(fā)展無酶的免疫傳感器對(duì)于靈敏地檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物具有非常重要的意義。在無酶的免疫傳感器的免疫傳感器中，金屬氧化物、貴金屬及其合金由于其優(yōu)良的生物相容性、導(dǎo)電性及催化活性被廣泛的應(yīng)用。在實(shí)際的應(yīng)用中，這些納米催化劑仍存在如下缺陷：一、納米催化劑由于其大的表面積和高的表面活性使其穩(wěn)定性較差，且容易聚集，這將會(huì)極大地降低其催化活性；二、金屬氧化物一般具有較差的導(dǎo)電性，這將極大地影響電催化反應(yīng)過程中電子的轉(zhuǎn)移速率。在各種各樣的金屬氧化物中，二氧化鈰（CeO2）由于其無毒性、良好的生物相容性、電催化活性等優(yōu)點(diǎn)使其廣泛地用于生物、醫(yī)藥、催化等領(lǐng)域。特別重要的一點(diǎn)是，CeO2可以提供大量的活性面和氧空位，表現(xiàn)出良好的類過氧化物酶性能，其對(duì)過氧化氫（H2O2）具有良好電催化還原能力。然而，CeO2納米晶體容易聚集且具有較差的導(dǎo)電性，這些缺陷將會(huì)極大地影響其電催化活性。因此，增強(qiáng)CeO2的導(dǎo)電性及分散性對(duì)提高其催化活性是非常有意義的。氮摻雜的石墨烯（NG）由于其獨(dú)特的二維結(jié)構(gòu)，大的比表面積和良好的電導(dǎo)性已經(jīng)被廣泛用作高性能的支撐材料。研究表明，氮摻雜不僅能夠加速電子在支撐材料與金屬界面的傳遞，而且可以增強(qiáng)納米粒子在支撐材料上的分散性。以NG為基礎(chǔ)的復(fù)合納米材料已經(jīng)引起了廣泛的研究興趣，由于不同組分的協(xié)同作用使其表現(xiàn)出更優(yōu)越的性能。另外，貴金屬（Ag）由于其優(yōu)越的電導(dǎo)性、良好的生物相容性、催化性能被廣泛應(yīng)用。因此，核殼結(jié)構(gòu)的Ag@CeO2與NG的復(fù)合材料（NG-Ag@CeO2）將會(huì)表現(xiàn)出良好的催化活性、生物相容性、電導(dǎo)性和大的表面積，將其標(biāo)記在信號(hào)抗體（Ab2）上，作為新型的模擬酶信號(hào)標(biāo)簽，有效地催化還原H2O2，實(shí)現(xiàn)分析信號(hào)的放大，提高檢測(cè)的靈敏度。在電化學(xué)免疫分析中，將特定的生物分子有效地固定在基質(zhì)上對(duì)于實(shí)現(xiàn)靈敏的分析具有重要的作用。一維的氧化鋅（ZnO）納米棒由于其導(dǎo)電性好、生物相容性高、成本低被廣泛應(yīng)用。本文采用簡(jiǎn)單的水熱法在修飾有金（Au）納米粒子的氧化銦錫（ITO）導(dǎo)電玻璃上合成了由一維ZnO納米棒組裝成的由中心出發(fā)向四周發(fā)散的三維放射狀的ZnO。該三維放射狀的ZnO具有大的表面積、良好的導(dǎo)電性和生物相容性，可以作為一個(gè)高性能的陣列用來負(fù)載大量的捕獲抗體（Ab1），進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度。本文首次合成了具有良好的催化活性、生物相容性、電導(dǎo)性和大的表面積的NG-Ag@CeO2，其對(duì)H2O2表現(xiàn)出良好的電催化還原能力，將其標(biāo)記在Ab2上，作為新型的模擬酶信號(hào)標(biāo)簽，可以極大地放大分析信號(hào)。此外，利用簡(jiǎn)單水熱法合成三維放射狀的ZnO，其表現(xiàn)出大的表面積、良好的導(dǎo)電性和生物相容性，可以負(fù)載大量的Ab1，進(jìn)一步提高免疫傳感器檢測(cè)的靈敏度。該高靈敏的無酶電化學(xué)免疫傳感器表現(xiàn)出線性范圍寬、檢測(cè)限低、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性高等優(yōu)良的分析性能，其在臨床分析不同的腫瘤標(biāo)志物方面具有良好的應(yīng)用前景。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是通過合成高性能的類酶納米催化劑NG-Ag@CeO2和三維放射狀的ZnO，構(gòu)建高靈敏的無酶電化學(xué)免疫傳感器，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤標(biāo)志物的準(zhǔn)確、靈敏檢測(cè)。為了解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的：（1）在ITO導(dǎo)電電極上沉積一層Au納米粒子：首先將ITO導(dǎo)電電極依次在丙酮、乙醇、二次水中各清洗10min，將清洗后的電極插入含有1%-5%HAuCl4的沉積液中，利用電位溶出分析法，在沉積電位為-0.2V，沉積時(shí)間為30-60s，將Au納米粒子沉積在ITO導(dǎo)電電極的表面，沉積完成后，用二次水清洗電極表面，并在室溫下自然干燥，獲得ITO-Au電極；（2）利用簡(jiǎn)單水熱法在步驟（1）中獲得ITO-Au電極表面生長(zhǎng)三維放射狀的ZnO：將ITO-Au電極插入含有10-15mL硝酸鋅和六次甲基四胺混合液的25mL高壓釜中，使ITO-Au電極傾斜地靠在高壓釜內(nèi)壁上，且導(dǎo)電面向下，所述的硝酸鋅和六次甲基四胺的濃度均為5-10mM且摩爾比為1:1，在90-100℃加熱4-6h，待冷卻到室溫后用二次水洗滌電極表面，并在60℃干燥3h，獲得ITO-Au-ZnO電極；（3）利用簡(jiǎn)單的水熱法合成類酶納米催化劑NG-Ag@CeO2，首先合成NG：將15-20mL28%氨水加入到20-25mL2mgmL?1氧化石墨烯分散液中，然后加入300-350mg氫氧化鈉，磁力攪拌30min，將獲得的混合液轉(zhuǎn)移到80mL的高壓釜中，在180-200℃加熱10-12h，待冷卻到室溫后，將獲得的混合液用0.01M的鹽酸離心洗滌至中性，再分別用乙醇和二次水各離心洗滌3次，最后將獲得的樣品在60℃真空干燥4h；然后合成NG-Ag：稱取5mgNG溶于5mL二次水中，超聲溶解30min，加入200-300μL70-80mM硝酸銀，在室溫下攪拌1h，隨后加入100-200μL30-40mM硼氫化鈉，繼續(xù)在室溫下攪拌1h后，用二次水離心洗滌3次，將獲得的NG-Ag重新分散在5mL二次水中；最后合成NG-Ag@CeO2：將0.2-0.4mmol硝酸鈰溶解在20mL二次水和20mL乙醇中，然后加入5mL獲得的NG-Ag，再逐滴加入10mL0.85%-1%的精氨酸，將獲得混合液在80-100℃磁力攪拌加熱3-5h，將獲得產(chǎn)品用丙酮和二次水各離心洗滌3次，并在60℃干燥3h；（4）合成NG-Ag@CeO2-Ab2：稱取2mgNG-Ag@CeO2分散在1mLpH7.4的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中，然后加入0.1mL2%3-氨丙基三乙氧基硅烷、0.1mL2.5%戊二醛和200μL20μgmL-1Ab2，在室溫下震蕩孵化2h，隨后用pH7.4PBS離心洗滌3次，獲得NG-Ag@CeO2-Ab2，將獲得NG-Ag@CeO2-Ab2重新分散在1mLpH7.4PBS中；（5）無酶電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建：將20μL0.1mM對(duì)氨基苯硫酚滴涂到步驟（2）中獲得的ITO-Au-ZnO電極表面，并在室溫下孵化4h，用pH7.4PBS洗滌除去多余的對(duì)氨基苯硫酚，然后再將ITO-Au-ZnO插入含有2.5%戊二醛的溶液中2h，用pH7.4PBS洗滌后，將10μL20μgmL-1Ab1滴涂到電極表面，并在室溫下孵化1h，用pH7.4本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種高靈敏的無酶電化學(xué)免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用，其特征是包括以下步驟：（1）在氧化銦錫（ITO）導(dǎo)電電極上沉積一層金（Au）納米粒子：首先將ITO導(dǎo)電電極依次在丙酮、乙醇、二次水中各清洗10?min，將清洗后的電極插入含有1%?5%?HAuCl4的沉積液中，利用電位溶出分析法，在沉積電位為?0.2?V，沉積時(shí)間為30?60?s，將Au納米粒子沉積在ITO導(dǎo)電電極的表面，沉積完成后，用二次水清洗電極表面，并在室溫下自然干燥，獲得ITO?Au電極；（2）利用簡(jiǎn)單水熱法在步驟（1）中獲得ITO?Au電極表面生長(zhǎng)三維放射狀的氧化鋅（ZnO）：將ITO?Au電極插入含有10?15?mL硝酸鋅和六次甲基四胺混合液的25?mL高壓釜中，使ITO?Au電極傾斜地靠在高壓釜內(nèi)壁上，且導(dǎo)電面向下，所述的硝酸鋅和六次甲基四胺的濃度均為5?10?mM且摩爾比為1:1，在90?100?℃加熱4?6?h，待冷卻到室溫后用二次水洗滌電極表面，并在60?℃干燥3?h，獲得ITO?Au?ZnO電極；（3）利用簡(jiǎn)單的水熱法合成由氮摻雜的石墨烯（NG）及核殼結(jié)構(gòu)的銀（Ag）和二氧化鈰（CeO2）復(fù)合成的類酶納米催化劑NG?Ag@CeO2，首先合成NG：將15?20?mL?28%?氨水加入到20?25?mL?2?mg?mL?1氧化石墨烯分散液中，然后加入300?350?mg氫氧化鈉，磁力攪拌30?min，將獲得的混合液轉(zhuǎn)移到80?mL的高壓釜中，在180?200?℃加熱10?12?h，待冷卻到室溫后，將獲得的混合液用0.01?M的鹽酸離心洗滌至中性，再分別用乙醇和二次水各離心洗滌3次，最后將獲得的樣品在60?℃真空干燥4?h；然后合成NG?Ag：稱取5?mg?NG?溶于5?mL二次水中，超聲溶解30?min，加入200?300?μL?70?80?mM硝酸銀，在室溫下攪拌1?h，隨后加入100?200?μL?30?40?mM硼氫化鈉，繼續(xù)在室溫下攪拌1?h后，用二次水離心洗滌3次，將獲得的NG?Ag重新分散在5?mL二次水中；最后合成NG?Ag@CeO2：將0.2?0.4?mmol硝酸鈰溶解在20?mL二次水和20?mL乙醇中，然后加入5?mL獲得的NG?Ag，再逐滴加入10?mL?0.85%?1%的精氨酸，將獲得混合液在80?100?℃磁力攪拌加熱3?5?h，將獲得產(chǎn)品用丙酮和二次水各離心洗滌3次，并在60?℃干燥3?h；（4）將NG?Ag@CeO2標(biāo)記在信號(hào)抗體（Ab2）上，獲得NG?Ag@CeO2?Ab2：稱取2?mgNG?Ag@CeO2分散在1?mL?pH?7.4的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中，?然后加入0.1?mL?2%?3?氨丙基三乙氧基硅烷、0.1?mL?2.5%?戊二醛和200?μL?20?μg?mL?1?Ab2，在室溫下震蕩孵化2?h，隨后用pH?7.4?PBS離心洗滌3次，獲得NG?Ag@CeO2?Ab2，將獲得NG?Ag@CeO2?Ab2重新分散在1?mL?pH?7.4?PBS中；（5）無酶電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建：將20?μL?0.1?mM對(duì)氨基苯硫酚滴涂到步驟（2）中獲得的ITO?Au?ZnO電極表面，并在室溫下孵化4?h，用pH?7.4?PBS洗滌除去多余的對(duì)氨基苯硫酚，然后再將ITO?Au?ZnO插入含有2.5%戊二醛的溶液中2?h，用pH?7.4?PBS洗滌后，將10?μL?20?μg?mL?1捕獲抗體（Ab1）滴涂到電極表面，并在室溫下孵化1?h，用pH?7.4?PBS洗滌除去未反應(yīng)的Ab1后，繼續(xù)滴涂10?mL?1%的牛血清白蛋白用于封堵非特異性結(jié)合位點(diǎn)，利用pH?7.4?PBS洗滌后，滴加10?μL不同濃度的腫瘤標(biāo)志物，在37?℃下孵化30?min，隨后用pH?7.4?PBS洗滌除去未反應(yīng)的腫瘤標(biāo)志物，最后滴涂10?μL步驟（4）中獲得的NG?Ag@CeO2?Ab2，并在37?℃下孵化40?min，用pH?7.4?PBS洗滌除去未反應(yīng)的NG?Ag@CeO2?Ab2，完成無酶電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建；（6）采用差分脈沖伏安法在由修飾后的ITO?Au?ZnO工作電極、Ag/AgCl參比電極和鉑對(duì)電極組成的三電極體系中進(jìn)行電化學(xué)信號(hào)檢測(cè)，電壓范圍為?1?~?0V，脈沖幅度為50?mV，脈沖寬度為50?ms，所用的檢測(cè)溶液為5?mL含有2?mM?H2O2的pH?7.4?PBS溶液，通過電化學(xué)信號(hào)與腫瘤標(biāo)志物濃度之間的關(guān)系，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)。...

【技術(shù)特征摘要】
1.一種高靈敏的無酶電化學(xué)免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用，其特征是包括以下步驟：（1）在氧化銦錫（ITO）導(dǎo)電電極上沉積一層金（Au）納米粒子：首先將ITO導(dǎo)電電極依次在丙酮、乙醇、二次水中各清洗10min，將清洗后的電極插入含有1%-5%HAuCl4的沉積液中，利用電位溶出分析法，在沉積電位為-0.2V，沉積時(shí)間為30-60s，將Au納米粒子沉積在ITO導(dǎo)電電極的表面，沉積完成后，用二次水清洗電極表面，并在室溫下自然干燥，獲得ITO-Au電極；（2）利用簡(jiǎn)單水熱法在步驟（1）中獲得ITO-Au電極表面生長(zhǎng)三維放射狀的氧化鋅（ZnO）：將ITO-Au電極插入含有10-15mL硝酸鋅和六次甲基四胺混合液的25mL高壓釜中，使ITO-Au電極傾斜地靠在高壓釜內(nèi)壁上，且導(dǎo)電面向下，所述的硝酸鋅和六次甲基四胺的濃度均為5-10mM且摩爾比為1:1，在90-100℃加熱4-6h，待冷卻到室溫后用二次水洗滌電極表面，并在60℃干燥3h，獲得ITO-Au-ZnO電極；（3）利用簡(jiǎn)單的水熱法合成由氮摻雜的石墨烯（NG）及核殼結(jié)構(gòu)的銀（Ag）和二氧化鈰（CeO2）復(fù)合成的類酶納米催化劑NG-Ag@CeO2，首先合成NG：將15-20mL28%氨水加入到20-25mL2mgmL?1氧化石墨烯分散液中，然后加入300-350mg氫氧化鈉，磁力攪拌30min，將獲得的混合液轉(zhuǎn)移到80mL的高壓釜中，在180-200℃加熱10-12h，待冷卻到室溫后，將獲得的混合液用0.01M的鹽酸離心洗滌至中性，再分別用乙醇和二次水各離心洗滌3次，最后將獲得的樣品在60℃真空干燥4h；然后合成NG-Ag：稱取5mgNG溶于5mL二次水中，超聲溶解30min，加入200-300μL70-80mM硝酸銀，在室溫下攪拌1h，隨后加入100-200μL30-40mM硼氫化鈉，繼續(xù)在室溫下攪拌1h后，用二次水離心洗滌3次，將獲得的NG-Ag重新分散在5mL二次水中；最后合成NG-Ag@CeO2：將0.2-0.4mmol硝酸鈰溶解在20mL二次水和20mL乙醇中，然...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：楊紅梅，張彥，李麗，于京華，葛慎光，顏梅，劉海云，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：濟(jì)南大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：山東;37