一種電擊轉化短小芽胞桿菌的方法技術

本發明專利技術公開了一種電擊轉化短小芽胞桿菌的方法，屬于微生物DNA轉化技術領域。本發明專利技術通過對短小芽胞桿菌電擊轉化條件的研究和探索，建立出最適合用于該菌的電擊轉化條件方案，大大提高了轉化效率，有利于推進短小芽胞桿菌表達系統的研究進展。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及微生物DNA轉化
，具體涉及一種電擊轉化短小芽胞桿菌的方法。
技術介紹
短小芽胞桿菌(Bacilluspumilus)為芽胞桿菌屬細菌，屬革蘭氏陽性菌，是一種具有前景的可作為外源基因表達系統開發的宿主菌。短小芽胞桿菌在重組表達基因方面具備大腸桿菌表達系統無法比擬的優點，如：①蛋白表達產物可高效分泌到培養基中，而且在多數情況下，異源重組蛋白經芽胞桿菌分泌后便具有天然構象和生物活性；②該細菌在傳統發酵工業中的應用已有幾十年歷史，無致病性、不產生內毒素，在國際科學界被認為是一種具生物安全性(GenerallyRecognizedasSafe，GRAS)的細菌；③分子遺傳學背景清楚，生長迅速、培養條件簡單；④具有獨特細胞壁結構，蛋白產物的分泌能力很強，自身胞外蛋白酶活性水平遠低于枯草芽胞桿菌。因此，短小芽胞桿菌非常適合外源蛋白的高效分泌表達，是一種潛在的比枯草芽胞桿菌更好的分泌表達宿主。針對短小芽胞桿菌的任何基因工程操作，都需要轉化質粒或DNA片段至細胞內。與枯草芽胞桿菌一樣，由于短小芽胞桿菌也不能形成感受態，因而采用電擊轉化法是最佳選擇。在電擊轉化過程中，伴隨電場強度增加，DNA進入受體細胞的效率會增大，但細胞死亡率也會相應提高，因而需要精巧平衡轉化效率和死亡率的關系，這樣才能增加獲得陽性轉化子的概率。目前國際上針對短小芽胞桿菌使用電擊轉化方法所獲的轉化效率很低(最高僅為～2×106cfu/μg)，因此通過對電擊轉化方法條件的研究與摸索，建立最適合用于短小芽胞桿菌電擊轉化的條件方案，是提高轉化效率、突破轉化效率瓶頸的必然途徑，將大大推進短小芽胞桿菌表達系統的研發進度。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是提供一種電擊轉化短小芽胞桿菌的方法，是將保存的短小芽胞桿菌活化后，加入PEB電擊緩沖液和待轉質粒DNA，在特定條件下進行電擊轉化。電擊轉化結束后，在特定條件下進行復蘇培養及涂布平板。最后隨機挑取轉化子進行鑒定。所述質粒DNA是任意的短小芽胞桿菌兼容質粒，所述短小芽胞桿菌是任意短小芽胞桿菌菌株。在本專利技術的上述實施方式中，所述將保存的短小芽胞桿菌活化方法，是將短小芽胞桿菌單菌落接入5mLLB培養基中，37℃中速振蕩培養12～16h。以2％的接種量轉接至50mLLB培養基中，250r/min搖菌至OD600為0.8～1.0。在本專利技術的上述實施方式中，所述PEB電擊緩沖液的配方為272mmol/L蔗糖，1mmol/LMgCl2，7mmol/LK2HPO4，磷酸調節pH至7.4。在本專利技術的上述實施方式中，所述在特定條件下進行電擊轉化，是指加入質粒DNA使其終濃度為2.5μg/mL，冰浴10min；然后取此混合液200μL加入到0℃預冷過的電擊杯中(電極距離0.2cm)，冰上放置，在電壓2.0～2.5kV，電容25μF，電阻200Ω條件下電擊。在本專利技術的上述實施方式中，所述在特定條件下進行復蘇培養及涂布平板，是指電擊結束后，立即加入800μLSOC培養基，37℃、150r/min培養3h。取200μL涂布于含抗生素的平板，37℃培養箱中培養16～24h。SOC培養基的配方為0.5％(W/V)酵母菌抽提物，2％(W/V)胰化蛋白胨，10mmol/LNaCl，2.5mmol/LKCl，10mmol/LMgCl2，20mmol/LMgSO4，20mmol/L葡萄糖。本專利技術相比現有技術的有益效果：據國內外現有公開文獻報道，目前針對短小芽胞桿菌使用電擊轉化方法所獲的最高轉化效率為～2×106cfu/μg，應用本電擊轉化方法所獲轉化效率為5～7×106cfu/μg，已顯著超越國際上已有報道的最高轉化效率。附圖說明圖1：pBE-S質粒圖譜圖2：pHT01質粒圖譜具體實施方式在本專利技術中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。下面結合具體的制備實施例和應用實施例，并參照數據進一步詳細地描述本專利技術。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本專利技術，而非以任何方式限制本專利技術的范圍。在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。實施例1pBE-S質粒轉化短小芽胞桿菌W3菌株。短小芽胞桿菌W3菌株是我們實驗室自行篩選并保存的一株菌株(保藏號：CCTCCNo.M2015018)。將短小芽胞桿菌W3單菌落接入5mLLB培養基中，37℃中速振蕩培養12h。以2％的接種量轉接至50mLLB培養基中，250r/min搖菌至OD600為1.0，置于冰浴20分鐘，以4000r/min離心10min，棄上清，無菌加入等體積的PEB電擊緩沖液懸浮，離心，重復2次，最后懸浮于0.8mLPEB溶液中。加入pBE-S質粒(圖1)使其終濃度為2.5μg/mL，冰浴10分鐘。然后，取此混合液200μL加入到0℃預冷過的電擊杯中(電極距離0.2cm)，冰上放置，在電壓2.1kV，電容25μF，電阻200Ω條件下電擊。電擊結束后，立即加入800μLSOC培養基，37℃、150r/min培養3h。取200μL涂布于含抗生素的平板，37℃培養箱中培養20h。隨機挑取200個轉化子，培養后進行鑒定，獲得轉化效率數據為6.1×106cfu/μg。實施例2pHT01質粒轉化短小芽胞桿菌W3菌株。短小芽胞桿菌W3菌株是我們實驗室自行篩選并保存的一株菌株(保藏號：CCTCCNo.M2015018)。將短小芽胞桿菌W3單菌落接入5mLLB培養基中，37℃中速振蕩培養12h。以2％的接種量轉接至50mLLB培養基中，250r/min搖菌至OD600為1.0，置于冰浴20分鐘，以4000r/min離心10min，棄上清，無菌加入等體積的PEB電擊緩沖液懸浮，離心，重復2次，最后懸浮于0.8mLPEB溶液中。加入pHT01質粒(圖2)使其終濃度為2.5μg/mL，冰浴10分鐘。然后，取此混合液200μL加入到0℃預冷過的電擊杯中(電極距離0.2cm)，冰上放置，在電壓2.2kV，電容25μF，電阻200Ω條件下電擊。電擊結束后，立即加入800μLSOC培養基，37℃、150r/min培養3h。取200μL涂布于含抗生素的平板，37℃培養箱中培養20h。隨機挑取200個轉化子，培養后進行鑒定，獲得轉化效率數據為5.4×106cfu/μg。實施例3pBE-S質粒轉化短小芽胞桿菌ZJ1115菌株。短小芽胞桿菌ZJ1115菌株的保藏號為CGMCCNo.1.7925。將短小芽胞桿菌ZJ1115單菌落接入5mLLB培養基中，37℃中速振蕩培養16h。以2％的接種量轉接至50mLLB培養基中，250r/min搖菌至OD600為0.9，置于冰浴20分鐘，以4000r/min離心10min，棄上清，無菌加入等體積的PEB電擊緩沖液懸浮，離心，重復2次，最后懸浮于1.0mLPEB溶液中。加入pBE-S質粒(圖1)使其終濃度為2.5μg/mL，冰浴10分鐘。然后，取此混合液200μL加入到0℃預冷過的電擊杯中(電極距離0.2cm)，冰上放置，在電壓2.5kV，電容25μF，電阻200Ω條件下電擊。電擊結束后，立即加入800μLSOC培養基，37℃、150r/min培養3h。取200μ本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種電擊轉化短小芽胞桿菌的方法，其特征在于，是將保存的短小芽胞桿菌活化后，加入PEB電擊緩沖液和待轉質粒DNA，在特定條件下進行電擊轉化。電擊轉化結束后，在特定條件下進行復蘇培養及涂布平板。最后隨機挑取轉化子進行鑒定。所述質粒DNA是任意的短小芽胞桿菌兼容質粒，所述短小芽胞桿菌是任意短小芽胞桿菌菌株。

【技術特征摘要】
1.一種電擊轉化短小芽胞桿菌的方法，其特征在于，是將保存的短小芽胞桿菌活化后，加入PEB電擊緩沖液和待轉質粒DNA，在特定條件下進行電擊轉化。電擊轉化結束后，在特定條件下進行復蘇培養及涂布平板。最后隨機挑取轉化子進行鑒定。所述質粒DNA是任意的短小芽胞桿菌兼容質粒，所述短小芽胞桿菌是任意短小芽胞桿菌菌株。2.根據權利要求1所述的短小芽胞桿菌活化方法，其特征在于，是將短小芽胞桿菌單菌落接入5mLLB培養基中，37℃中速振蕩培養12～16h。以2％的接種量轉接至50mLLB培養基中，250r/min搖菌至OD60...

【專利技術屬性】
技術研發人員：管政兵，王凱強，陳宇，廖祥儒，蔡宇杰，
申請(專利權)人：江南大學，
類型：發明
國別省市：江蘇;32