檢測人類CYP1A2基因分型的引物及探針、試劑盒、方法技術

本發明專利技術屬于基因分型技術領域，具體涉及一種檢測人類CYP1A2基因分型的引物及探針、試劑盒、方法。引物及探針包含以下核苷酸序列：上游引物SEQ?ID?NO:1：5’?AAACTGAGATGATGTGTGGAGG?3’；下游引物SEQ?ID?NO:2：5’?CACGCATCAGTGTTTATCAAA?3’；探針SEQ?ID?NO:3：5’?GTGGGCCCAGGACGCATGGTAGATGGA?3’。試劑盒包括上述引物及探針、dNTPs、MgCl2，以及由UNG酶和有瓣狀核酸內切酶活性的DNA聚合酶組成的混合酶，陽性和陰性對照品。用該試劑盒檢測CYP1A2基因分型的方法，可一條熒光探針檢測目標核酸SNP位點上的不同分型，簡化了操作過程，節約了成本，檢測結果分辨率高、迅速準確。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于基因分型
，具體涉及一種檢測人類CYP1A2基因分型的引物及探針、試劑盒、方法。
技術介紹
細胞色素P450超家族中，與藥物代謝相關的代謝酶主要是CYP1、CYP2、CYP3家族。CYP1A2是CYP1A亞家族的重要成員，是人肝臟中最重要的CYP酶之一，占肝臟CYP酶總量的13～15％。CYP1A2在肝組織中有特異性表達，芳胺、雜環胺及一些含鹵烴化物均是其重要底物。具有遺傳多態性，存在個體、種族差異性，導致不同個體、種族的藥物代謝能力存在差異。CYP1A2*1F(-163C>A)位于1號內含子，突變會增加CYP1A2的活性。CYP1A2的不同基因型直接影響藥物療效和毒副作用的強弱，因此根據CYP1A2的基因型來指導準確、安全用藥具有重要的臨床意義。用于檢測基因多態性的方法主要有測序法、PCR-RFLP(聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性)、基因芯片法、熒光定量PCR法。測序法結果準確，但成本高、耗時長。PCR-RFLP通過酶切電泳的方法檢測基因多態性，成本低、結果直觀，但操作過程易受污染，導致錯誤結果。基因芯片法通過核酸雜交檢測基因型，優點是通量高，缺點是成本較高，操作繁瑣，結果難判讀。傳統熒光定量PCR法依據其原理不同可分為熒光PCR探針法和熒光PCR熔解曲線法。前者針對目標SNP位點設計兩種探針，分別和野生型與突變型匹配，利用擴增的Ct值差異來判讀基因型。后者針對目標SNP位點設計一種探針，基于探針與目標核酸之間雜交的準確性(即SNP位點上不同堿基造成熔解溫度的差異)來判讀基因型。傳統的熒光定量PCR法檢測的準確度依賴于探針與對應的等位基因之間的親和程度的差別，即其溶解溫度(Tm)的差別，當這種差別并不是很大時，往往導致最終的檢測結果存在偏差，準確度不高。隨著技術的不斷創新，一種基于瓣狀核酸內切酶及雙熒光標記探針的新型SNP檢測技術被開發出來。該方法采用具有瓣狀核酸內切酶活性的DNA聚合酶，并利用這種聚合酶在切除瓣狀結構中的5’端單鏈時的切割位置位于瓣狀結構的雙鏈部分的第一個堿基和第二個堿基之間這一特性，結合修飾有雙重熒光標記及淬滅基團的DNA探針，實現了用一個熒光探針檢測目標核酸SNP位點上的分型。目前針對CYP1A2基因分型的檢測方法局限上述基因芯片法、傳統熒光定量PCR探針法，其缺點越來越難以滿足臨床檢驗的要求。在利用雙熒光標記探針的新型SNP檢測技術檢測CYP1A2基因分型的研究，還沒有人報道。
技術實現思路
本專利技術目的在于克服現有技術的不足，通過自主設計引物和探針，并結合基于瓣狀核酸內切酶及雙熒光標記探針的新型SNP檢測技術，提供一種檢測人類CYP1A2基因分型的引物及探針、試劑盒、方法，以解決目前針對CYP1A2基因分型檢測的局限性問題。為了實現上述專利技術目的，本專利技術采用的技術方案如下：用于檢測人類CYP1A2基因分型的引物及探針，包含以下核苷酸序列：上游引物SEQIDNO:1：5’-AAACTGAGATGATGTGTGGAGG-3’；下游引物SEQIDNO:2：5’-CACGCATCAGTGTTTATCAAA-3’；探針SEQIDNO:3：5’-GTGGGCCCAGGACGCATGGTAGATGGA-3’。本專利技術提供的引物和探針能準確檢測到CYP1A2基因突變位點區域。本專利技術還提出一種檢測人類CYP1A2基因分型的試劑盒，所述試劑盒包含PCR反應液，所述PCR反應液包括上述引物及探針。本專利技術提供的試劑盒成本低，使用簡單，能準確檢測CYP1A2基因分型。本專利技術還提供一種利用上述試劑盒檢測人類CYP1A2基因分型的方法，其包括如下步驟：提取人基因組DNA；將所述DNA與所述試劑盒配成反應體系，進行熒光定量PCR擴增；根據所述擴增結果分析所述CYP1A2基因分型。本專利技術提供的檢測CYP1A2基因分型的方法，用一條熒光探針即可檢測目標核酸SNP位點上的多種分型，簡化了操作過程，節約了成本，檢測結果分辨率高、迅速準確。另外，本專利技術還提供利用上述試劑盒在檢測CYP1A2基因分型中的用途。該用途可破除現有CYP1A2基因分型檢測的局限性，相對現有技術，更易滿足臨床檢驗的要求。附圖說明圖1是CYP1A2基因-163位點野生型檢測結果圖；圖2是CYP1A2基因-163位點純合突變型檢測結果圖；圖3是CYP1A2基因-163位點雜合型檢測結果圖；圖4是CYP1A2基因-163位點純合突變型對比試驗檢測結果圖。具體實施方式為了使本專利技術要解決的技術問題、技術方案及有益效果更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本專利技術進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本專利技術，并不用于限定本專利技術。本專利技術實施例提供一種用于檢測人類CYP1A2基因分型的引物及探針，包含以下核苷酸序列：上游引物SEQIDNO:1：5’-AAACTGAGATGATGTGTGGAGG-3’；下游引物SEQIDNO:2：5’-CACGCATCAGTGTTTATCAAA-3’；探針SEQIDNO:3：5’-GTGGGCCCAGGACGCATGGTAGATGGA-3’。該探針第7個核苷酸到3’端之間的序列與目標核酸上相應序列互補，該CYP1A2基因的突變為c.-163C>A。本實施例的引物和探針能準確檢測CYP1A2基因突變位點區域。具體地，在探針5’端和3’端分別用兩種不同的熒光報告基團標記，優選地，熒光報告基團選自：FAM、HEX、TET、VIC、ROX、CY5、CY3、JOE、ALEX、CAL；在探針的第8位核苷酸位點用熒光淬滅基團標記。在本實施例中，DNA探針的5’端及3’端分別有一個發出綠色熒光(FAM)及紅色熒光(VIC)的基團雙重標記，而在SNP位點的下一個堿基(沿5’端到3’端的方向地8個堿基)上修飾有一個淬滅基團(IDT公司的ZENTMInternalQuencher)，該淬滅基團能夠同時淬滅綠色熒光基團及紅色熒光基團的熒光。雙重熒光標記DNA探針上由SNP位點到其3’端之間的序列與目標核酸上相應序列互補，而由SNP位點到其5’端之間的序列與目標核酸上相應序列不互補，因此形成瓣狀結構。本專利技術實施例還提供一種檢測人類CYP1A2基因分型的試劑盒，該試劑盒包含由上述引物及探針組成的PCR反應液，其中：上游引物濃度為：0.1-0.5μM；下游引物濃度為：0.1-0.5μM；探針濃度為：0.1-0.5μM。具體在本實施例中，上游引物0.5μM；下游引物0.5μM；探針0.5μM。該試劑盒成本低，使用簡單，能準確檢測CYP1A2基因分型。具體地，該試劑盒還含有dNTPs，MgCl2。其中dNTPs濃度為：0.2-0.5mM；MgCl2濃度為：0.5-2.5mM；本實施例中，優選dNTPs0.5mM；MgCl22.5mM。具體地，該試劑盒還包含UNG酶和DNA聚合酶，該DNA聚合酶具有瓣狀核酸內切酶活性。由于DNA聚合酶具有瓣狀核酸內切酶活性，當正向引物被延伸至熒光探針處時，熒光探針上不與目標核酸互補的序列會被聚合酶切除。切割位置在瓣狀結構的雙鏈部分的第一個堿基和第二個堿基之間。當目標核酸上SNP位點的堿基與熒光探針上的對應堿基互補時，則在SNP位點和下一個堿基之間切除。因此，綠色熒光基本文檔來自技高網...

【技術保護點】
用于檢測人類CYP1A2基因分型的引物及探針，包含以下核苷酸序列：上游引物SEQ?ID?NO:1：5’?AAACTGAGATGATGTGTGGAGG?3’；下游引物SEQ?ID?NO:2：5’?CACGCATCAGTGTTTATCAAA?3’；探針SEQ?ID?NO:3：5’?GTGGGCCCAGGACGCATGGTAGATGGA?3’。

【技術特征摘要】
1.用于檢測人類CYP1A2基因分型的引物及探針，包含以下核苷酸序列：上游引物SEQIDNO:1：5’-AAACTGAGATGATGTGTGGAGG-3’；下游引物SEQIDNO:2：5’-CACGCATCAGTGTTTATCAAA-3’；探針SEQIDNO:3：5’-GTGGGCCCAGGACGCATGGTAGATGGA-3’。2.如權利要求1所述的引物及探針，其特征在于，所述探針5’端和3’端分別用兩種不同的熒光報告基團標記，所述熒光報告基團選自：FAM、HEX、TET、VIC、ROX、CY5、CY3、JOE、ALEX、CAL；所述探針的第8位核苷酸位點用熒光淬滅基團標記。3.如權利要求1或2所述的引物及探針，其特征在于，所述CYP1A2基因的突變為c.-163C>A。4.一種檢測人類CYP1A2基因分型的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含PCR反應液，所述PCR反應液包括如權利要求1-3任一所述的引物及探針。5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應液中，上游引物濃度為：0.1-0.5μM；下游引物濃度為：0.1-0.5μM；探針濃度為：0.1-0.5μM。6.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于...

【專利技術屬性】
技術研發人員：譚愛女，羅曉騰，郭永超，周代志，
申請(專利權)人：深圳聯合醫學科技有限公司，
類型：發明
國別省市：廣東;44