本發(fā)明專利技術(shù)屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種應(yīng)用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)魚成纖維細胞的工藝，所述工藝包括魚成纖維細胞在BC?7L生物反應(yīng)器中貼壁懸浮培養(yǎng)以及在BC?75L生物反應(yīng)器中在線放大培養(yǎng)的工藝。本發(fā)明專利技術(shù)提供的魚類成纖維細胞應(yīng)用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)工藝，既可以保證細胞的高培養(yǎng)密度，又可以提高培養(yǎng)過程細胞的活力，實現(xiàn)了魚細胞自動化培養(yǎng)傳代放大技術(shù)，培養(yǎng)得到的魚成纖維細胞形態(tài)飽滿，細胞分裂生長同步性好，M期細胞活力強，分裂細胞數(shù)量倍增，保持了原細胞的活力和遺傳特性，增強了細胞對病毒的易感性和繁殖病毒的能力，可用于繁殖和大規(guī)模生產(chǎn)魚類病毒。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物
，具體涉及一種應(yīng)用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)魚成纖維細胞的工藝。
技術(shù)介紹
魚類細胞培養(yǎng)始于20世紀(jì)60年代，主要用于病毒學(xué)的研究。目前魚類細胞系(株)的應(yīng)用已經(jīng)很廣泛，由單純的病毒分離和鑒定擴展到魚類胚胎干細胞、免疫學(xué)、毒理學(xué)和腫瘤學(xué)、生理學(xué)和內(nèi)分泌學(xué)、遺傳育種和基因工程、活性物質(zhì)、抗病毒藥物和藥物檢測以及魚類資源保護等方面的研究中。魚類細胞培養(yǎng)技術(shù)，包括培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等，對細胞培養(yǎng)成功起著至關(guān)重要的作用。魚類細胞培養(yǎng)的與哺乳動物細胞比，魚類細胞的耐溫和耐受的滲透壓范圍更為寬廣，因此培養(yǎng)條件相對沒那么嚴(yán)格，同時，與哺乳動物細胞培養(yǎng)不同，魚類細胞不需要頻繁地傳代以維持細胞活力，傳代后的培養(yǎng)條件也不需要經(jīng)常改變。但由于魚類細胞培養(yǎng)起步較晚，目前魚類細胞培養(yǎng)的原理以及技術(shù)都是借鑒哺乳動物細胞培養(yǎng)，魚類細胞的培養(yǎng)條技術(shù)有待進一步優(yōu)化，研究魚類細胞培養(yǎng)的最佳方法是目前魚類細胞研究的重點之一。隨著魚類疫苗、細胞因子、生長因子、單克隆抗體、酶等細胞生物產(chǎn)品的研究、開發(fā)和生產(chǎn)，魚類細胞培養(yǎng)趨于大規(guī)模化。目前國內(nèi)外鮮見應(yīng)用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)魚類細胞并自動放大培養(yǎng)的報道，多見于用于科學(xué)研究的小規(guī)模的培養(yǎng)方式。如：劉秋鳳等發(fā)表的論文“微載體規(guī)模化培養(yǎng)草魚細胞與病毒的工藝及優(yōu)化”公開了在4L雙側(cè)臂細胞培養(yǎng)瓶和磁力攪拌裝置組成的懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中使用微載體Cephodex規(guī)模化培養(yǎng)草魚腎臟組織細胞CIK的條件；陳志宏等發(fā)表的論文“生物反應(yīng)器微載體系統(tǒng)大規(guī)模培養(yǎng)草魚細胞及病毒”公開了在1.5LCelliGen細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中使用微載體GT-2和Cytodex3規(guī)模化培養(yǎng)草魚吻端細胞的工藝條件。現(xiàn)有應(yīng)用微載體大規(guī)模培養(yǎng)魚類貼壁細胞并自動放大培養(yǎng)技術(shù)，在實踐中發(fā)現(xiàn)存在細胞貼壁率低，細胞培養(yǎng)密度低，細胞收率低，培養(yǎng)過程微載體易聚集等問題，需要進一步的研究和完善。經(jīng)檢索，到目前為止，未見有關(guān)7L到75L生物反應(yīng)器大規(guī)模在線自動化放大培養(yǎng)，自動化消化，微載體懸浮培養(yǎng)魚成纖維細胞的工藝的報道。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于克服現(xiàn)有的技術(shù)缺陷，提供一種應(yīng)用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)魚成纖維細胞的工藝。本專利技術(shù)實現(xiàn)了魚細胞在BC-7L生物反應(yīng)器中貼壁懸浮培養(yǎng)以及在BC-75L生物反應(yīng)器中在線自動化放大培養(yǎng)，打破了應(yīng)用二級生物反應(yīng)器在線培養(yǎng)魚成纖維細胞不成功的神話，突破了魚類細胞培養(yǎng)的難點。本專利技術(shù)提供的魚類成纖維細胞應(yīng)用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)工藝，既可以保證細胞的高培養(yǎng)密度，又可以提高培養(yǎng)過程細胞的活力，實現(xiàn)了魚細胞自動化培養(yǎng)傳代放大技術(shù)，培養(yǎng)得到的魚成纖維細胞形態(tài)飽滿，細胞分裂生長同步性好，M期細胞活力強，分裂細胞數(shù)量倍增，保持了原細胞的活力和遺傳特性，增強了細胞對病毒的易感性和繁殖病毒的能力，可用于繁殖和大規(guī)模生產(chǎn)魚類病毒。本專利技術(shù)的技術(shù)方案如下：一種應(yīng)用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)魚成纖維細胞的工藝，包括如下步驟：S1：取生長良好的魚成纖維細胞，細胞計數(shù)后接種至含有細胞生長液和已進行預(yù)處理的微載體的7L生物反應(yīng)器中進行自動化培養(yǎng)，其中，細胞生長液加入量為2.5-4L，微載體加入量為5-6g/L，細胞接種密度為1.0-1.5×104個/mL，細胞接種時間為1-3min，生物反應(yīng)器自動化控制技術(shù)參數(shù)設(shè)置為：溶氧40-50％，pH7.1-7.3，溫度34℃，攪拌轉(zhuǎn)速50-80rpm；S2：細胞在生物反應(yīng)器中連續(xù)自動化培養(yǎng)5-7天至細胞長成致密單層后，停止攪拌，使微載體自然沉降5-10min，棄細胞生長液，用PBS溶液沖洗微載體2-3次，沖洗過程反應(yīng)器轉(zhuǎn)速40-60rpm；S3：在7L生物反應(yīng)器內(nèi)加入1-2L0.1-0.2％胰蛋白酶消化液室溫攪拌消化5-10min，攪拌轉(zhuǎn)速為30-50rpm，最后停止攪拌，加入2-4L細胞生長液終止消化，靜置5-10min使微載體自然沉降，得細胞懸液；S4：將S3所得細胞懸液在線自動傳輸放大到含有細胞生長液和已進行預(yù)處理的微載體的75L生物反應(yīng)器中進行培養(yǎng)，其中，細胞生長液的加入量為35-45L，微載體加入量為2-2.5g/L，細胞接種密度為1.1-1.5×104個/mL，生物反應(yīng)器自動化控制技術(shù)參數(shù)設(shè)置為：溶氧40-50％，pH7.1-7.3，溫度34℃，轉(zhuǎn)速40-60rpm，連續(xù)自動化培養(yǎng)7天。本專利技術(shù)提供的應(yīng)用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)魚成纖維細胞的工藝中，生物反應(yīng)器可在線實現(xiàn)細胞自動消化，自動傳輸和自動放大培養(yǎng)的過程，并可通過細胞生長代謝趨勢PID曲線監(jiān)控細胞培養(yǎng)過程中細胞的生長趨勢。優(yōu)選地，所述步驟S2中，PBS溶液的pH值為7.3-7.6。優(yōu)選地，所述細胞生長液包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基，按體積百分比計，還包括胎牛血清5-8％。優(yōu)選地，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基選自L-15、DMEM、RPMI1640、MEM和DMEM/F12中的一種。優(yōu)選地，所述微載體的預(yù)處理包括如下步驟：取微載體，加入微載體3-4倍重量的PBS溶液，攪拌均勻后在室溫下浸泡中和2-3h，棄去上清；再用相同體積的PBS溶液清洗2次；加入微載體重量9-12倍量的PBS溶液，攪拌均勻后121℃蒸汽高壓滅菌25-30min，備用。優(yōu)選地，所述微載體的預(yù)處理步驟中，所述PBS溶液的pH值為7.3-7.6。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)的有益效果是：(1)本專利技術(shù)提供的應(yīng)用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)魚成纖維細胞的工藝，實現(xiàn)了魚成纖維細胞的大規(guī)模微載體培養(yǎng)和自動放大培養(yǎng)，實現(xiàn)了魚細胞在BC-7L生物反應(yīng)器中貼壁懸浮培養(yǎng)以及在BC-75L生物反應(yīng)器中在線自動化放大培養(yǎng)，打破了應(yīng)用二級生物反應(yīng)器在線培養(yǎng)魚成纖維細胞不成功的神話，突破了魚類細胞培養(yǎng)的難點；(2)本專利技術(shù)提供的應(yīng)用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)魚成纖維細胞的工藝中，生物反應(yīng)器可在線實現(xiàn)細胞自動消化，自動傳輸和自動放大培養(yǎng)的過程，并可通過細胞生長代謝趨勢PID曲線監(jiān)控細胞培養(yǎng)過程中細胞的生長趨勢。(3)本專利技術(shù)提供的魚類成纖維細胞應(yīng)用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)工藝，既可以保證細胞的高培養(yǎng)密度，又可以提高培養(yǎng)過程細胞的活力，實現(xiàn)了魚細胞自動化培養(yǎng)傳代放大技術(shù)，培養(yǎng)得到的魚成纖維細胞形態(tài)飽滿，細胞分裂生長同步性好，M期細胞活力強，分裂細胞數(shù)量倍增，保持了原細胞的活力和遺傳特性，增強了細胞對病毒的易感性和繁殖病毒的能力，可用于繁殖和大規(guī)模生產(chǎn)魚類病毒；附圖說明圖1魚成纖維細胞應(yīng)用BC-7L生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)過程的細胞生長曲線。圖2應(yīng)用BC-7L生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)24h、48h、72h、96h時利用光學(xué)顯微鏡觀察到的魚成纖維細胞在微載體上的生長形態(tài)。圖3魚成纖維細胞應(yīng)用BC-7L生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)過程的細胞生長代謝趨勢PID曲線；其中，曲線1表示細胞培養(yǎng)過程中氧飽和度變化，曲線2表示細胞培養(yǎng)過程中pH的變化，曲線3表示細胞培養(yǎng)過程中溫度的變化，曲線4表示細胞培養(yǎng)過程中攪拌轉(zhuǎn)速的變化，曲線5為PID曲線，代表細胞生長趨勢，表示細胞培養(yǎng)過程中細胞耗氧量的變化值，耗氧量增加細胞數(shù)增加。圖4魚成纖維細胞應(yīng)用BC-75L生物反應(yīng)器在線放大傳代懸浮培養(yǎng)過程的細胞生長曲線。圖5應(yīng)用BC-75L生物反應(yīng)器在線放大傳代懸浮培養(yǎng)24h、48h、72h、96h時利用光學(xué)顯微鏡觀察到的魚成纖維細胞在微載體上的生長形態(tài)。圖6魚成纖維細胞應(yīng)用BC-75L生物反應(yīng)器在線放大傳本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種應(yīng)用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)魚成纖維細胞的工藝，其特征在于，所述工藝包括如下步驟：S1：取生長良好的魚成纖維細胞，細胞計數(shù)后接種至含有細胞生長液和已進行預(yù)處理的微載體的7L生物反應(yīng)器中進行自動化培養(yǎng)，其中，細胞生長液加入量為2.5?4L，微載體加入量為5?6g/L，細胞接種密度為1.0?1.5×104個/mL，細胞接種時間為1?3min，生物反應(yīng)器自動化控制技術(shù)參數(shù)設(shè)置為：溶氧40?50％，pH?7.1?7.3，溫度34℃，攪拌轉(zhuǎn)速50?80rpm；S2：細胞在生物反應(yīng)器中連續(xù)自動化培養(yǎng)5?7天至細胞長成致密單層后，停止攪拌，使微載體自然沉降5?10min，棄細胞生長液，用PBS溶液沖洗微載體2?3次，沖洗過程反應(yīng)器轉(zhuǎn)速40?60rpm；S3：在7L生物反應(yīng)器內(nèi)加入1?2L?0.1?0.2％胰蛋白酶消化液室溫攪拌消化5?10min，攪拌轉(zhuǎn)速為30?50rpm，最后停止攪拌，加入2?4L細胞生長液終止消化，靜置5?10min使微載體自然沉降，得細胞懸液；S4：將S3所得細胞懸液在線自動傳輸放大到含有細胞生長液和已進行預(yù)處理的微載體的75L生物反應(yīng)器中進行培養(yǎng)，其中，細胞生長液的加入量為35?45L，微載體加入量為2?2.5g/L，細胞接種密度為1.1?1.5×104個/mL，生物反應(yīng)器自動化控制技術(shù)參數(shù)設(shè)置為：溶氧40?50％，pH?7.1?7.3，溫度34℃，轉(zhuǎn)速40?60rpm，連續(xù)自動化培養(yǎng)7天。...
【技術(shù)特征摘要】
1.一種應(yīng)用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)魚成纖維細胞的工藝，其特征在于，所述工藝包括如下步驟：S1：取生長良好的魚成纖維細胞，細胞計數(shù)后接種至含有細胞生長液和已進行預(yù)處理的微載體的7L生物反應(yīng)器中進行自動化培養(yǎng)，其中，細胞生長液加入量為2.5-4L，微載體加入量為5-6g/L，細胞接種密度為1.0-1.5×104個/mL，細胞接種時間為1-3min，生物反應(yīng)器自動化控制技術(shù)參數(shù)設(shè)置為：溶氧40-50％，pH7.1-7.3，溫度34℃，攪拌轉(zhuǎn)速50-80rpm；S2：細胞在生物反應(yīng)器中連續(xù)自動化培養(yǎng)5-7天至細胞長成致密單層后，停止攪拌，使微載體自然沉降5-10min，棄細胞生長液，用PBS溶液沖洗微載體2-3次，沖洗過程反應(yīng)器轉(zhuǎn)速40-60rpm；S3：在7L生物反應(yīng)器內(nèi)加入1-2L0.1-0.2％胰蛋白酶消化液室溫攪拌消化5-10min，攪拌轉(zhuǎn)速為30-50rpm，最后停止攪拌，加入2-4L細胞生長液終止消化，靜置5-10min使微載體自然沉降，得細胞懸液；S4：將S3所得細胞懸液在線自動傳輸放大到含有細胞生長液和已進行預(yù)處理的微載體的75L生物反應(yīng)器中進行培養(yǎng)，其中，細胞生長液的加入量為35-45L，微載體加入量為2-2.5g/L，細胞接種密度為1.1-1.5×104個/mL，生物反應(yīng)器自動化控制技術(shù)參數(shù)設(shè)置為：溶氧40-50％，pH7.1-7.3，溫度34℃，轉(zhuǎn)速40-6...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：任政華，伍活鐮，尹順義，郜巖，
申請(專利權(quán))人：廣州齊志生物工程設(shè)備有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：廣東;44
還沒有人留言評論。發(fā)表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。