一種鑒定簇毛麥染色體的核酸探針及其應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了一對(duì)寡核苷酸，以及由此制備的核酸探針。該兩條核酸探針可在簇毛麥大部分染色體上較好彌散分布，結(jié)合已知的寡聚核酸探針Oligo?pTa535可快速、準(zhǔn)確地鑒定出小麥遺傳背景中的簇毛麥染色體和/或染色體片段。該技術(shù)省時(shí)省力、成本低，可達(dá)到類似GISH的雜交效果。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于染色體工程領(lǐng)域，具體涉及一種鑒定簇毛麥染色體的核酸探針及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
一年生二倍體簇毛麥(2n＝14,VV)是小麥重要的近緣種屬，攜帶多種抗蟲、抗病及抗非生物逆境等優(yōu)良基因(DePaceC2011)。早在上世紀(jì)50年代，研究者就開始進(jìn)行一年生二倍體簇毛麥遺傳物質(zhì)向小麥遺傳背景的轉(zhuǎn)移研究。Sears(1953)首先使用二粒小麥與簇毛麥進(jìn)行雜交，得到硬粒小麥-簇毛麥雙二倍體植株。Blanco等(1988)得到6VS在硬粒小麥中的雙端體附加系，該株系遺傳穩(wěn)定且抗白粉病。1991年，Blanco等鑒定得到硬粒小麥″Creso″與簇毛麥的完整單體附加系。Qi等(1995；1998a)在簇毛麥6VS染色體上挖掘到抗小麥白粉病基因Pm21。近年來(lái)，攜帶Pm21基因的6AL/6VS易位系已經(jīng)被導(dǎo)入不同小麥遺傳背景中，并培育出入南農(nóng)9918，內(nèi)麥9號(hào)等高產(chǎn)抗病的小麥新品種中(陳佩度等,2002)。細(xì)胞學(xué)鑒定是鑒定、追蹤小麥背景中外源染色體(片段)的最主要、最直接的手段。熒光原位雜交(FISH)由于其穩(wěn)定性、直觀性成為細(xì)胞學(xué)鑒定手段中最常用的技術(shù)。基因組熒光原位雜交(GISH)是FISH中的一種，其以物種總基因組為探針，可準(zhǔn)確鑒定出小麥遺傳背景中的外源染色體(片段)及小麥異源易位系中染色體的斷裂-結(jié)合點(diǎn)。但是傳統(tǒng)的FISH/GISH技術(shù)操作程序復(fù)雜，不僅耗時(shí)耗力而且成本較高(Zhangetal,2015)。而新開發(fā)的結(jié)合Oligo核酸序列為探針的ND-FISH技術(shù)則因其成本低，省時(shí)省力的特點(diǎn)近年來(lái)得到廣泛的使用(Tangetal,2014)。在該技術(shù)中，Tang等(2014)基于幾個(gè)來(lái)自黑麥、小麥等物種的重復(fù)序列pAs1，pSc119.2,pTa-535,pTa71,CCS1,和pAWRC.1的序列信息，設(shè)計(jì)相應(yīng)的長(zhǎng)度約為60bp的Oligo序列(oligo指寡聚核苷酸序列，一般為DNA單鏈)。并以這些Oligo序列為探針，結(jié)合ND-FISH，最后可根據(jù)Oligo探針在不同染色體上表達(dá)的不同模式快速、準(zhǔn)確地分辨出小麥A、B、D及黑麥R染色體。同時(shí)，Oligo-pSc119.2,Oligo-pTa-535兩種探針的結(jié)合也可鑒別小麥A、B染色體組與簇毛麥V組染色體(說(shuō)明書附圖1a，圖1c)，Oligo-(GAA)n可在硬粒小麥-簇毛麥雙二倍體(2n＝42，ABV)中較好區(qū)分出小麥B組染色體(說(shuō)明書附圖1b，圖1c)。隨后，F(xiàn)u等(2015)又根據(jù)來(lái)自黑麥重復(fù)序列1162、pSc200和pSc250設(shè)計(jì)了Oligo-1162,Oligo-pSc200和Oligo-pSc250三種Oligo探針。這三種Oligo探針可較好地涂布在所有的黑麥R組染色體上，達(dá)到類似GISH的效果。目前，這種可較好涂布在染色體上以達(dá)到GISH雜交效果的Oligo探針在除黑麥之外的其余小麥近緣物種中尚無(wú)報(bào)道。現(xiàn)有技術(shù)針對(duì)簇毛麥染色體的Oligo序列探針技術(shù)方案為：(1)探針開發(fā)：根據(jù)在簇毛麥染色體上彌散分布的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子C1-10(Zhangetal，2013)信息，通過(guò)BLAST比對(duì)，篩選與小麥重復(fù)序列同源性較低的60bp區(qū)段。同時(shí)在RepeatMasker上進(jìn)行驗(yàn)證，以保證所選擇的60bp區(qū)段具有重復(fù)序列的特征基序。(2)探針制備：將這些序列信息送與Invitrogen(英濰捷基)生物公司進(jìn)行合成，并在5’端連接熒光基團(tuán)TAM。(3)探針驗(yàn)證：以這些連接了熒光基團(tuán)的Oligo序列為探針，與硬粒小麥-簇毛麥雙二倍體(2n＝42，ABV)進(jìn)行雜交，以驗(yàn)證該探針對(duì)簇毛麥染色體的特異性。由于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子可分為數(shù)個(gè)亞家族，不同的亞家族在染色體上的分布區(qū)域不盡相同。如：分布于染色體臂、染色體端部、或著絲粒區(qū)域等。另外，在同一物種的不同染色體上分布也有不同。因此，基于一條反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列設(shè)計(jì)的oligo探針，不能如GISH一樣在染色體的所有區(qū)域及同一外源物種的不同染色體都有較好的雜交效果。參考文獻(xiàn)DePaceC,VaccinoP,CioniniPG,PasquiniM,BizzarriM,QualsetCO.Dasypyrum.KoleC(eds)Wildcroprelatives:genomicandbreedingresources[C].Springer-Verlag,Berlin,German.2011,pp:185-291SearsER.AdditionofthegenomeofD.villosumtoT.Aestivum[J].Am.J.Bot.1953,40,168-174.BlancoA,PerroneV,RestaP,SimeoneR,UrbanoM.TheincorporationofpowderymildewresistancefromDasypyrumvillosum(L.)Candargytodurumwheat[J].1988.GenetAgrar42:62BlancoA,RestaP,SimeoneR,ParmarS,ShewryPR,SabelliP,LafiandraD.ChromosomallocationofseedsstorageproteingenesinthegenomeofDasypvrumvillosum(L.)Candargy[J].TheorApplGenet.1991,82:358–362QiLL,ChenPD,LiuDJ,ZhouB,ZhangSZ.DevelopmentoftranslocationlinesofTriticumaestivumwithpowderymildewresistanceintroducedfromHaynaldiavillosa.In:LiZS,XinZY(eds)Proceedingsofthe8thinternationalwheatgeneticssymposium.ChinaAgricultureSciencetechPress.Beijing,China,1995,pp:333–337QiLL,WangSL,ChenPD,LiuDJ,GillBS.IdentificationandphysicalmappingofthreeHaynaldiavillosachromosome-6Vdeletionlines.TheorApplGenet.1998b,97:1042–1046陳佩度,張守忠,王秀娥,王蘇玲,周波,馮祎高,劉大均.抗白粉病高產(chǎn)小麥新品種南農(nóng)9918[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,25(4):105-106ZhangJ,JiangY,GuoYL,LiGR,YangZJ,XuDL,XuP.Identificationofnovelchromosomalaberrationsinducedby60Co-γ-irradiationinwheat-Dasypyrumvillosumlines.IntJMolSci.2015,16,29787-29796Tang,Z.X.；Yang,Z.J.；Fu,S.L.OligonucleotidesreplacingtherolesofrepetitivesequencespAs1,p本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一對(duì)寡核苷酸，由核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO.1所示的第一鏈和核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO.2所示的第二鏈組成。

【技術(shù)特征摘要】
1.一對(duì)寡核苷酸，由核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示的第一鏈和核苷酸序列如序列表SEQIDNO.2所示的第二鏈組成。2.一對(duì)核酸探針，由核酸探針1和核酸探針2組成；所述核酸探針1包括序列表SEQIDNO.1所示的寡核苷酸和標(biāo)記基團(tuán)，其中寡核苷酸的5’端與標(biāo)記基團(tuán)連接；所述核酸探針2包括序列表SEQIDNO.2所示的寡核苷酸和標(biāo)記基團(tuán)，其中寡核苷酸的5’端與標(biāo)記基團(tuán)連接。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸探針，其特征在于，所述標(biāo)記基團(tuán)為4-甲基-6羧羅丹明。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸探針，其特征在于，所述核酸探針1為序列表SEQIDNO.1所示的寡核苷酸的5’端與4-甲基-6羧羅丹明連接得到，所述核酸探針2由序列表SEQIDNO.2所示的寡核苷酸與4-甲基-6羧羅丹明連接得到。5.權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述核酸探針用于檢測(cè)簇毛麥染色體的用途。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述染色體為簇毛麥與小麥雜交品種中的簇毛麥染色體和\...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張潔，蔣云，宣樸，郭元林，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：四川;51