水稻高精度分子標(biāo)記Xa7?SM5及其育種利用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種水稻Xa7基因高精度分子標(biāo)記Xa7?SM5，分子標(biāo)記的擴(kuò)增引物選自下列引物對(duì)，正向：5’TCTAGCTACAGAATCCGATCGAAT?3’，反向：5’CCAATTAGCAATCCTGTGTACCAT?3’。其能用于含Xa7的水稻與不含Xa7的水稻之間的分子檢測(cè)及其后代的標(biāo)記輔助選擇；當(dāng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳中含有如SEQ?ID?NO：1所示序列時(shí)，為含Xa7的水稻；反之，則為不含Xa7的水稻。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一個(gè)高抗水稻白葉枯病的基因的DNA標(biāo)記及其在育種中的應(yīng)用，屬于分子遺傳育種領(lǐng)域。
技術(shù)介紹
水稻白葉枯病是一種世界性的細(xì)菌病害，它與稻瘟病、紋枯病一起被稱為水稻的“三大病害”。水稻遭遇白葉枯病后，一般減產(chǎn)20～30％，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)50％，甚至絕收。發(fā)掘和利用抗病基因是防治水稻白葉枯病的最有效方法。迄今，國(guó)際上在水稻中已鑒定了近40個(gè)抗白葉枯病基因(國(guó)家水稻數(shù)據(jù)中心http://www.ricedata.cn)，但是只有少數(shù)幾個(gè)兼具全生育期、廣譜、持久等良好的抗病特性，真正能有效地用于水稻抗白葉枯病的育種和生產(chǎn)的基因并不多。水稻Xa7是一個(gè)來(lái)自孟加拉稻種的國(guó)際上公認(rèn)的白葉枯病高抗基因，是水稻抗病育種中一個(gè)較為理想的抗源。因此，利用分子標(biāo)記輔助育種(MAS)技術(shù)，將Xa7基因?qū)胫髟缘碾s交稻恢復(fù)系中，有望大大提高我國(guó)水稻的抗病性和生產(chǎn)安全。而開發(fā)目的基因的高精度分子標(biāo)記，是基因分子育種的關(guān)鍵，更能大大提高基因鑒定的精確度。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種水稻高抗白葉枯病基因特異性標(biāo)記Xa7-SM5及其應(yīng)用，本專利技術(shù)能用于Xa7基因的精準(zhǔn)鑒定及其在水稻育種中應(yīng)用。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本專利技術(shù)提供一種水稻Xa7基因高精度分子標(biāo)記，以水稻作為物種，該分子標(biāo)記的擴(kuò)增引物選自下列引物對(duì)，其中的核苷酸序列為5′→3′，Xa7-SM5正向：5’TCTAGCTACAGAATCCGATCGAAT3’，反向：5’CCAATTAGCAATCCTGTGTACCAT3’。即，本專利技術(shù)提供了一個(gè)可以特異性鑒定抗白葉枯病Xa7基因的緊密連鎖或共分離標(biāo)記(即，水稻抗白葉枯病基因Xa7的DNA標(biāo)記)，該標(biāo)記為Xa7-SM5。本專利技術(shù)還同時(shí)提供了上述水稻Xa7基因高精度分子標(biāo)記Xa7-SM5的用途，其特征是：用于含Xa7的水稻與不含Xa7的水稻之間的分子檢測(cè)及其后代的標(biāo)記輔助選擇。即，用于Xa7基因的精準(zhǔn)的鑒定及其在水稻育種中應(yīng)用。作為本專利技術(shù)的水稻Xa7基因高精度分子標(biāo)記Xa7-SM5的用途的改進(jìn)：當(dāng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳中含有如SEQIDNO：1所示序列時(shí)，為含Xa7的水稻；反之，則為不含Xa7的水稻。即，引物Xa7-SM5PCR擴(kuò)增所得的分子標(biāo)記Xa7-SM5在含Xa7品種(例如IRBB7)中的序列如SEQIDNO：1所述；引物Xa7-SM5PCR擴(kuò)增所得的分子標(biāo)記Xa7-SM5在不含Xa7品種(例如IR24)中不含有SEQIDNO：1所述序列。本專利技術(shù)還提供了上述水稻抗白葉枯病Xa7基因標(biāo)記Xa7-SM5的用途：用于水稻Xa7基因的分子標(biāo)記輔助選擇育種。專利技術(shù)人在專利技術(shù)過(guò)程中，首先，利用“圖位克隆”技術(shù)將Xa7基因精細(xì)定位于水稻第6染色體的50kb間，并分別構(gòu)建了水稻含Xa7品種IRBB7與其近等基因系不含Xa7品種IR24的基因組文庫(kù)，通過(guò)測(cè)序和比對(duì)兩個(gè)品種定位區(qū)間的序列，發(fā)現(xiàn)IRBB7存在一些IR24中沒(méi)有的差異序列。將這些序列在國(guó)際權(quán)威的生物學(xué)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行比對(duì)，在現(xiàn)有的水稻DNA數(shù)據(jù)中沒(méi)有搜索到相同或相似的序列，表明在IRBB7中這些序列是新發(fā)現(xiàn)的水稻基因組序列。因此，本專利技術(shù)利用以上序列中的1個(gè)位點(diǎn)，開發(fā)了1個(gè)新的DNA標(biāo)記，用于精確的檢測(cè)Xa7基因，在Xa7遺傳育種中可以比較快速、精確的鑒定Xa7基因，大大提高基因轉(zhuǎn)育的效率。本專利技術(shù)的具體
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
如下：根據(jù)以上在水稻IRBB7中發(fā)現(xiàn)的1個(gè)新DNA序列，分別設(shè)計(jì)PCR引物，開發(fā)出1個(gè)對(duì)應(yīng)的DNA標(biāo)記Xa7-SM5。用這個(gè)標(biāo)記的引物，分別對(duì)含Xa7基因與不含Xa7基因的水稻品種基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在含Xa7水稻品種的PCR產(chǎn)物中檢測(cè)到808bp(如SEQIDNO：1所示)的條帶，而不含Xa7水稻品種的PCR產(chǎn)物中檢測(cè)不到無(wú)相應(yīng)的條帶(圖1)。表明標(biāo)記Xa7-SM5與Xa7基因具有很高的一致性，能精確的分析待測(cè)水稻品種是否含有Xa7基因，在Xa7遺傳育種中可以大大提高基因轉(zhuǎn)育的效率。利用本專利技術(shù)檢測(cè)出某個(gè)水稻品種內(nèi)是否含有“Xa7基因位點(diǎn)”的最終目的是：確認(rèn)在被測(cè)定水稻品種中是否含有Xa7基因。一般現(xiàn)在可采用白葉枯病菌的抗譜分析來(lái)鑒定Xa7基因的存在，但是該方法需要多個(gè)菲律賓生理小種，接菌條件包括水稻的生育時(shí)期、氣候、溫度等也比較嚴(yán)格，且鑒定可靠性不夠高。本專利技術(shù)操作簡(jiǎn)單，該標(biāo)記的穩(wěn)定性好，不受其它基因效應(yīng)和環(huán)境因素的影響，可以大大提高Xa7基因的鑒定精確性，適于推廣應(yīng)用。本專利技術(shù)對(duì)水稻抗白葉枯的品種改良具有重要意義，可直接用于Xa7基因的輔助選擇育種。附圖說(shuō)明下面結(jié)合附圖對(duì)本專利技術(shù)的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。圖1為IRBB7和IR24的Xa7-SM5標(biāo)記檢測(cè)圖；圖1中：M.Marker；1.含Xa7基因的水稻品種IRBB7；2.不含Xa7基因的水稻品種IR24。圖2為各種已知含Xa7與不含Xa7水稻品種的Xa7-SM5標(biāo)記檢測(cè)圖；圖2中：M.Marker；含Xa7基因的水稻品種：1.IRBB7(對(duì)照)，2.DV85，3.鎮(zhèn)恢084；不含Xa7基因的水稻品種：4.日本晴，5.9311，6.浙輻802，7.中花11，8.TP309。圖3轉(zhuǎn)育Xa7基因的成恢448的Xa7-SM5標(biāo)記檢測(cè)圖；圖3中：M.Marker；1.IRBB7(對(duì)照)；2.成恢448(不含Xa7)；3.成恢448(轉(zhuǎn)育了Xa7)。圖4轉(zhuǎn)育Xa7基因的成恢448的白葉枯病抗性鑒定圖；圖4中：橫坐標(biāo)P1～P10，國(guó)際公認(rèn)用來(lái)鑒定水稻白葉枯病抗性的10個(gè)不同白葉枯病原菌小種；縱坐標(biāo)，水稻葉片侵染白葉枯病菌后病斑的長(zhǎng)度(單位cm)，病斑越短表明抗病性越強(qiáng)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本專利技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本專利技術(shù)的保護(hù)范圍并不僅限于此。實(shí)施例1、1、引物合成：委托LifeTechnologies公司合成Xa7-SM5標(biāo)記的引物，引物序列為：5’TCTAGCTACAGAATCCGATCGAAT3’和5’CCAATTAGCAATCCTGTGTACCAT3’。2、DNA提取：以水稻的葉片為材料提取基因組DNA，已報(bào)道的DNA提取方法很多，可任意選擇一種，本案例采用的是Panaud等(MolGenGenet,1996,252:597-607)報(bào)道的方法。3、PCR擴(kuò)增：在0.2ml的PCR擴(kuò)增專用薄壁管中，加入20ng水稻DNA、兩條引物各0.25μM、2×TaqPCRMasterMix(TIANGEN公司)、用ddH2O定容到20μl，充分混勻。PCR擴(kuò)增在熱循環(huán)儀上進(jìn)行，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5分鐘。本專利技術(shù)采用的熱循環(huán)儀為Biometra公司的T3000型。4、PCR產(chǎn)物的電泳：用1×TAE電泳液制備濃度為1％(w/w)的瓊脂糖凝膠，取步驟3所得的PCR產(chǎn)物10μl，與1μl10×LoadingBuffer混合，加到凝膠的點(diǎn)樣孔中，在100V恒壓下電泳30分鐘。用溴化乙錠(Ethidiumbromide，EB)對(duì)凝膠進(jìn)行染色，顯示DNA條帶，染色方法按照《分子克隆》(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，第三版)。5、電泳圖譜分析：在紫外本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
水稻Xa7基因高精度分子標(biāo)記Xa7?SM5，以水稻作為物種，其特征是：所述分子標(biāo)記的擴(kuò)增引物選自下列引物對(duì)，其中的核苷酸序列為5′→3′，Xa7?SM5?正向：5’TCTAGCTACAGAATCCGATCGAAT?3’，反向：5’CCAATTAGCAATCCTGTGTACCAT?3’。

【技術(shù)特征摘要】
1.水稻Xa7基因高精度分子標(biāo)記Xa7-SM5，以水稻作為物種，其特征是：所述分子標(biāo)記的擴(kuò)增引物選自下列引物對(duì)，其中的核苷酸序列為5′→3′，Xa7-SM5正向：5’TCTAGCTACAGAATCCGATCGAAT3’，反向：5’CCAATTAGCAATCCTGTGTACCAT3’。2.如權(quán)利要求1所述的水...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：馬伯軍，陳曉龍，劉輝，陳析豐，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：浙江師范大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：浙江;33