一種人腫瘤抑制蛋白變體及其應用制造技術

本發明專利技術提供了一種人腫瘤抑制蛋白的變體。該蛋白變體相對于野生型具有更強的抑制腫瘤細胞生長的效果。這些變體蛋白質和它們的衍生物可以被多種腫瘤的治療。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物
，具體地說，本專利技術涉及腫瘤抑制蛋白變體。
技術介紹
KIAA0157定位于10q26.13(NM_032182.)，mRNA全長3008bp，cDNA1248bp，編碼416個氨基酸(序列2)，分子量為47KD的蛋白質。小鼠、大鼠與人的KIAA0157同源性高達90％以上，說明它在進化過程中高度保守，可能發揮著重要的生物學功能。利用生物信息學分析顯示，KIAA0157蛋白內部215-266位氨基酸處存在著一個coiledcoil結構域，此結構域通常存在于單體蛋白質中，且高度保守，通常介導蛋白與蛋白之間的相互作用。在對抗凋亡蛋白BPE(BRCA復合體亞基4)的相互作用蛋白篩選過程中，KIAA0157被篩選到。該基因及蛋白為全細胞分布，并在多種腫瘤組織中明顯下調表達。高表達KIAA0157可抑制包括肝癌細胞\\肺癌細胞\\神經母細胞瘤細胞的生長，并導致細胞發生G0/G1期阻滯。在現有技術中，為了提高蛋白的活性，針對蛋白的活性位點進行特異性的突變和取代，從而尋找活性更高的變體是常規的做法。為了進一步提高該蛋白的生物活性，申請人通過大量的實驗，針對KIAA0157氨基酸序列中特定的位點進行了點突變，從而獲得了比KIAA0157蛋白本身具有更高抑制活性的變體。專利技術詳述本專利技術涉及親本蛋白的分離的變體，其在至少一個對應于SEQIDNO:1的成熟多肽的位置I40H、H57Q、K85P、W94Q、Q110S、H113G、H141Y、N151A、S159P、L160P、K190I、Y213I、V220F、A222Y、R232P、V241Q、R260P、S267T、D276E、S286L、D298S、D303L、Y308K、P313K、Q316S、T319H、H322S、S328A、M331Q、R333R、G338A、P359I、G366F、S372I和P383L的位置包含修飾。具體而言，本專利技術的變體具有改善的抑制活性。優選地，應用于本專利技術的方法、呈現改善的熱穩定性和抑制活性的蛋白變體包含至少2種任一下述修飾：I40H/A222Y、H57Q/V220F、K85P/H322S、W94Q/S328A、Q110S/H113G、H141Y/P383L、N151A/G366F、L160P/P383L、K190I/D298S、K85P/R232P、V241Q/S286L、H57Q/R260P、S286L/P383L、W94Q/D298S、Y213I/D303L、Q316S/S372I、Q110S/G338A。本專利技術還涉及產生本專利技術的蛋白變體的方法，包括(a)培養宿主細胞；和(b)回收所述蛋白變體。在本專利技術的產生方法中，使用本領域熟知的方法在適合于產生所述多肽的營養培養基中培養細胞。例如，可以通過在合適培養基中和允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行的搖瓶培養，和實驗室或工業發酵罐中的小規?；虼笠幠０l酵(包括連續、分批、補料分批或固態發酵)來培養細胞。使用本領域已知的方法在合適的營養培養基中進行培養，所述營養培養基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養基能夠從商業供應商獲得或可以根據公開的組成制備(例如，在美國典型培養物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養培養基中，該多肽能夠從所述培養基中直接回收。如果多肽不分泌，其能夠從細胞裂解物(lysate)回收。所得多肽可以使用本領域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常規方法從營養培養基中回收，所述常規方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發或沉淀。本專利技術的多肽可以通過多種本領域已知的方法純化，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或提取(參見，例如，ProteinPurification,J.-C.Janson和LarsRyden編,VCHPublishers,NewYork,1989)。本專利技術的多肽用于制備相應的藥物，用于治療癌癥，優選的，治療肝癌。具體實施方式實施例1：KIAA0157基因的獲得提出人骨髓細胞總RNA，按反轉錄試劑盒(Promega公司)說明書進行反轉錄。取1μg定量后的RNA，加水補至10.5μl，70℃、10min，加入2μl的10×buffer、2μl的MgCl2、2μl的dNTP、1μl的oligodT、1μl的rRNasin、1.5μl的AMV(15U)，反應體系共20μl；42℃、1h；94℃、5min；4℃、5min。RNA即反轉錄為cDNA。以5’-CGGAATTCAATGTCCTACAGAGAGCAGGTT-3’；5’-GGGGATCCTTAAATCTGGGAGGTCTGAGTG-3’為引物PCR擴增目的片段。PCR條件為：Cycle1(1x)94℃5minCycle2(30x)94℃1min55℃30s72℃1minCycle3(1x)72℃10minPCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，結果產生特異的DNA條帶，將該DNA片段與PMD-18-T載體(TAKARA生物公司)連接，連接產物轉化E.coliJM109，菌落PCR鑒定為陽性克隆后，再經酶切鑒定后測序。測序后的序列為序列1所示。實施例2：相應突變后的KIAA0157的獲得方法1.突變點的引入(1)根據相應的突變位點設計相應的誘變引物，采用PCR定點突變法在KIAA0157基因上把野生型對應的氨基酸位點進行突變；(2)上述PCR產物經膠回收純化后，用限制性內切酶進行酶切，與經過相同酶切的質粒pPIC9k片段連接后，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞；2.鑒定重組質粒：用酶切、PCR方法對重組質粒進行鑒定，并測序檢驗，由此得到突變后的核苷酸序列。實施例3、KIAA0157變體過表達抑制細胞集落形成為了研究KIAA0157變體對細胞增殖有影響，我們構建了KIAA0157變體-myc/hisB+真核表達載體，并采用集落形成實驗檢測了KIAA0157變體在HepG2細胞中過表達后其增殖的變化情況。結果如下：表1KIAA0157變體過表達抑制細胞集落形成情況實施例4KIAA0157變體表達引起HepG2細胞G0/G1期阻滯為了解KIAA0157變體對HepG2細胞周期的影響，我們在HepG2細胞轉染了帶GFP標簽的KIAA0157的真核表達載體，流式細胞儀檢測細胞周期各時相的分布。通過實驗發現，與轉染KIAA0157原始蛋白相比，轉染KIAA0157變體的真核表達載體后HepG2細胞出現G0/G1期阻滯的變化，結果如下：表2KIAA0157變體針對HepG2細胞G0/G1期阻滯的影響水平序列表<110>朱育盼〈120〉一種人腫瘤抑制蛋白變體及其應用〈160〉1〈210〉1〈211〉416〈212〉PRT〈213〉人種(HomoSapiens.)〈400〉1MetAlaAlaSerIleSerGlyTyrThrPheSerAlaValCysPheHis16SerAlaAsnSerAsnAlaAspHisGluGlyPheLeuLeuGlyGluVal32ArgGlnGl本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種人腫瘤抑制蛋白，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO：1所示。

【技術特征摘要】
1.一種人腫瘤抑制蛋白，其氨基酸序列為SEQIDNO：1所示。2.一種人腫瘤抑制蛋白變體，其特征在于，在SEQIDNO：1所示的氨基酸的基礎上，在K85P/R232P上進行相應的取代...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李露青，
申請(專利權)人：李露青，
類型：發明
國別省市：浙江;33