人SFRP1變體及其應用制造技術

本發明專利技術公開了一種人SFRP1蛋白變體，及其在制備抑制腫瘤生長的藥物中的應用。使本發明專利技術的人SFRP1變體在癌細胞中過量表達，或通過體外補給人SFRP1蛋白變體，以控制癌細胞增殖并殺死癌細胞。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物
，具體地說，本專利技術涉及腫瘤抑制蛋白變體。
技術介紹
SFRP，分泌型Frz相關蛋白(secretedfrizzled-relatedproteins)，含有一個富含半胱氨酸的結構域(cysteinerichdomain，CRD)，但缺少七次跨膜域，它可能與卷曲蛋白(frizzled，Frz)競爭結合Wnt蛋白，從而抑制Wnt蛋白的過量表達。Wnt是一類分泌型糖蛋白，對人體正常細胞增殖起調整促進作用。近期實驗發現，抑制這種蛋白質作用的基因SFRP發生異常時，Wnt蛋白質的機能會隨之出現異常，使得癌細胞不斷增殖，導致發生大腸癌。當把正常的SFRP基因注入癌細胞后，就會控制癌細胞增殖和殺死癌細胞。研究表明，90％的大腸癌患者與SFRP基因異常有關。在現有技術中，為了提高蛋白的活性，針對蛋白的活性位點進行特異性的突變和取代，從而尋找活性更高的變體是常規的做法。為了進一步提高該蛋白的生物活性，申請人通過大量的實驗，針對SFRP1氨基酸序列中特定的位點進行了點突變，從而獲得了比SFRP1蛋白本身具有更高抑制活性的變體。專利技術詳述本專利技術涉及親本蛋白的分離的變體，其在至少一個對應于SEQIDNO:1的成熟多肽的位置34Y、39F、42D、50R、58C、63A、89E、100L、122L、137R、151W、174A、198I、220N、242D、271M、286K或293E的位置包含修飾。具體而言，本專利技術的變體具有改善的抑制活性。優選地，應用于本專利技術的方法、呈現改善的抑制活性的蛋白變體為以下任一修飾：34Y/A、39F/D、42D/R、50R/S、58C/G、63A/H、89E/A、100L/D、122L/R、137R/S、151W/G、174A/R、198I/A、220N/S、242D/G、271M/D、286K/R或293E/L。本專利技術還涉及產生本專利技術的蛋白變體的方法，包括(a)培養宿主細胞；和(b)回收所述蛋白變體。在本專利技術的產生方法中，使用本領域熟知的方法在適合于產生所述多肽的營養培養基中培養細胞。例如，可以通過在合適培養基中和允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行的搖瓶培養，和實驗室或工業發酵罐中的小規模或大規模發酵(包括連續、分批、補料分批或固態發酵)來培養細胞。使用本領域已知的方法在合適的營養培養基中進行培養，所述營養培養基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養基能夠從商業供應商獲得或可以根據公開的組成制備(例如，在美國典型培養物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養培養基中，該多肽能夠從所述培養基中直接回收。如果多肽不分泌，其能夠從細胞裂解物(lysate)回收。所得多肽可以使用本領域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常規方法從營養培養基中回收，所述常規方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發或沉淀。本專利技術的多肽可以通過多種本領域已知的方法純化，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或提取(參見，例如，ProteinPurification,J.-C.Janson和LarsRyden編,VCHPublishers,NewYork,1989)。本專利技術的多肽用于制備相應的藥物，去用于治療癌癥。具體實施方式1.SFRP1基因的獲得PCR擴增SFRP1的ORF區共314個氨基酸，模板為含有人類基因組的樣本。兩端引入酶切位點BamHI和EcoRI，酶切后與用同樣的酶消化的pET載體連接，轉化大腸桿菌后挑單克隆，測序。測得其氨基酸序列如序列1所示。所用的引物序列如下，SFRP1的引物為(不去除終止密碼不含his-myc)：Sfrpl3.1B(-)：F：5’-CGGGATCCATGGGCATCGGG-3’：R：5’-CGGAATTCCGTCACTTAAACACGGACT-3’。2.SFRP1變體的構建突變點的引入(1)根據相應的突變位點設計相應的誘變引物，采用PCR定點突變法在SFRP1基因上把野生型對應的氨基酸位點進行突變；(2)上述PCR產物經膠回收純化后，用限制性內切酶進行酶切，與經過相同酶切的質粒PCDNA3.1片段連接后，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞；3.2.鑒定重組質粒：用酶切、PCR方法對重組質粒進行鑒定，并測序檢驗，由此得到突變后的核苷酸序列。4.PCDNA3.1-SFRP1變體質粒構建將第二步構建獲得的SFRP1變體基因的兩端引入酶切位點BamHI和EcoRI，酶切后與用同樣的酶消化的PCDNA3.1連接，鑒定后，將質粒轉染細胞株：7721肝癌細胞，檢驗SFRP1變體能的抑制肝癌細胞生長的效果。具體結果如下：表1SFRP1變體過表達抑制細胞生長情況通過上述結果可以看出，一些突變體對肝癌細胞生長的抑制活性相對于野生型SFRP1蛋白有了大幅度的提高，可以進一步應用于肝癌治療。序列表<110>李露青〈120〉人SFRP1變體及其應用〈160〉1〈210〉1〈211〉314〈212〉PRT〈213〉智人(Homosapiens)〈400〉11MGIGRSEGGRRGAALGVLLALGAALLAVGSASEYDYVSFQSDIGPYQSGR51FYTKPPQCVDIPADLRLCHNVGYKKMVLPNLLEHETMAEVKQQASSWVPL101LNKNCHAGTQVFLCSLFAPVCLDRPIYPCRWLCEAVRDSCEPVMQFFGFY151WPEMLKCDKFPEGDVCIAMTPPNATEASKPQGTTVCPPCDNELKSEAIIE201HLCASEFALRMKIKEVKKENGDKKIVPKKKKPLKLGPIKKKDLKKLVLYL251KNGADCPCHQLDNLSHHFLIMGRKVKSQYLLTAIHKWDKKNKEFKNFMKK301MKNHECPTFQSVFK本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種人SFRP1蛋白，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO：1所示。

【技術特征摘要】
1.一種人SFRP1蛋白，其氨基酸序列為SEQIDNO：1所示。2.一種人SFRP1蛋白變體，其特征在于，在SEQIDNO：1所示的氨基酸的基礎上，在293...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李露青，
申請(專利權)人：李露青，
類型：發明
國別省市：浙江;33