一種多功能靶向納米膠囊抗癌藥物的制備方法技術

本發明專利技術提出了一種新型多功能靶向納米膠囊抗癌藥物的分子設計與合成技術，利用羧基化的嵌段共聚物F127?COOH和P123將紫杉醇包裹形成納米膠束，并使用四甲氧基硅烷在膠束中形成一層二氧化硅殼穩定膠束結構以形成載藥納米膠囊；然后通過偶聯劑將納米膠囊表面的羧基與TRAIL蛋白表面的氨基偶聯，形成表面偶聯TRAIL蛋白的載藥納米膠囊。本發明專利技術的技術方法重復性好、條件溫和，制備的多功能靶向納米膠囊抗癌藥物穩定，抗癌譜廣且療效顯著。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及的是一種新型多功能靶向納米膠囊抗癌藥物的設計與合成技術，特別是一種包載紫杉醇的納米膠囊表面偶聯腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體TRAIL蛋白的抗癌藥物的設計與制備。
技術介紹
在全球范圍內，惡性腫瘤的治療是當今生命科學研究領域的一個難點。化療是當前腫瘤治療的主要手段之一，化療常用的藥物有紫杉醇（PTX）、阿霉素、柔紅霉素、絲裂霉素等，但由于化療藥物的選擇性不強，在殺滅癌細胞的同時也會不可避免地損傷人體正常的細胞，常常出現藥物不良反應，存在毒性、非特異性和耐藥性問題。腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(tumornecrosisfactor-relatedapoptosisinducingligand,TRAIL)是一種人源性蛋白，作為一種新的抗腫瘤藥物，可以在體內選擇性地誘導腫瘤細胞系凋亡而不會對正常細胞有毒性，在腫瘤的治療中有廣泛的潛在應用前景。但是，單獨使用TRAIL蛋白也存在不足之處，有些癌腫瘤對TRAIL蛋白不敏感。目前國內外的研究多集中在TRAIL蛋白與化療藥物的聯合用藥上，試圖發揮TRAIL蛋白和化療藥物的雙重功效以解決TRAIL蛋白敏感性問題并增強殺癌療效。聯合使用紫杉醇等化療藥物雖可提高非敏感性腫瘤細胞表面TRAIL蛋白受體，但仍缺乏靶向性和存在毒性問題。近年來TRAIL在動物體內的靶向性已經得到證實，綜合利用TRAIL的抗腫瘤作用和靶向作用是新的研究方向。隨著科技的發展，性能優良的高分子材料在醫藥行業發展迅速。載藥納米微粒是納米技術與現代醫藥學結合的產物，是一種新型的藥物輸送載體。它能緩釋藥物、延長藥物作用時間，透過生物屏障輸送藥物等，尤其在藥物控釋方面顯示出其它輸送體系無法比擬的優勢。因此，我們試圖將化療藥物包載進羧基化的嵌段共聚物F127-COOH和P123納米微粒內，并在膠束中添加四甲氧基硅烷形成一層二氧化硅殼以穩定膠束結構，形成載藥納米膠囊；然后通過載藥納米膠囊表面的羧基（-COOH）與TRAIL蛋白的氨基（-NH2）偶聯，形成一種在細胞和腫瘤水平均具有良好殺癌效果的新型多功能靶向納米膠囊抗癌藥物。
技術實現思路
本專利技術的目的是提出一種新型多功能靶向納米膠囊抗癌藥物的分子設計與制備方法。首先通過嵌段共聚物F127羧基化修飾獲得F127-COOH，然后將化療藥物包載進羧基化的嵌段共聚物F127-COOH和P123納米微粒內，并添加四甲氧基硅烷形成一層二氧化硅殼以穩定膠束結構，形成載藥納米膠囊，最后通過載藥膠囊表面的羧基（-COOH）與TRAIL蛋白的氨基（-NH2）偶聯，制備出一種同時兼具靶向、抗癌、緩釋等特點的新型多功能靶向納米膠囊抗癌藥物，其分子結構見圖1。這種新型人工合成的納米紫杉醇荷載膠囊-TRAIL蛋白藥物（TRAIL-PTX-NCs））既具有靶向性、緩釋化學藥物又具有TRAIL蛋白和化學藥物雙重殺癌作用。同時，它有效地發揮了TRAIL蛋白和化學藥物的殺癌特性，克服彼此存在的缺點。納米紫杉醇荷載膠囊-TRAIL蛋白藥物既可用于治療TRAIL蛋白敏感的瘤細胞又可用于治療TRAIL蛋白不敏感的癌細胞。一種新型多功能靶向納米膠囊抗癌藥物的設計與合成技術，其步驟為：1、嵌段共聚物F127的羧基化修飾將F127加入到無水甲苯中，攪拌至F127完全溶解，形成溶液A；向溶液A中加入與F127等重的丁二酸酐，攪拌后形成溶液B；將溶液B在150℃下沸浴加熱5h，減壓下蒸餾將甲苯蒸發，蒸餾后殘液用二氯甲烷洗滌，然后加入乙醚沉淀產物，產物用乙醚重結晶，最后得到F127-COOH；所述F127與無水甲苯的質量體積比為1:1，質量體積比單位為mg:ml。2、載藥納米膠囊的制備稱取P123和F127-COOH超聲溶解于氯仿溶液，并加入紫杉醇或其它疏水性藥物，100W超聲分散15min，得到的混合溶液在75℃下真空干燥1h以上，待氯仿完全蒸發完后得到一層納米薄膜，向薄膜內加入去離子水，200W超聲分散12min即得到包載紫杉醇的載藥納米膠束；取四甲氧基硅烷超聲分散于四氫呋喃溶液中，逐滴加入到載藥納米膠束中，并置于磁力攪拌儀上以750rpm轉速攪拌3天，四甲氧基硅烷在膠束中水解形成一層二氧化硅殼，形成載藥納米膠囊；所述P123與F127-COOH的質量比為2:1-0.5,紫杉醇與P123、F127-COOH混合物的質量比為1:70-300；所述的四甲氧基硅烷與四氫呋喃的用量為：四甲氧基硅烷與四氫呋喃的體積比為7:100，四甲氧基硅烷與載藥納米膠束的體積比為1:100-1000。3、載藥納米膠囊與TRAIL蛋白的偶聯在pH7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）以及載藥納米膠囊，室溫避光旋轉反應1h活化膠囊表面的羧基；將反應后的溶液裝入截留分子量為8000g/mol的透析袋，置于PBS溶液中透析24h以除去未反應的EDC和NHS，再向透析后的溶液中加入TRAIL蛋白，4℃避光旋轉反應8-16h，即得到偶聯TRAIL蛋白的載藥納米膠囊，所述磷酸鹽緩沖液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺、載藥納米膠囊的用量比為3:5:6:1,單位為ml:mg:mg:ml；所述TRAIL蛋白用量與載藥納米膠囊用量比為1:10-40；單位為mg:ml。4、載藥納米膠囊的形態檢測和穩定性測定取20μl載藥納米膠囊滴加在碳支持膜型銅網上，室溫條件下晾干。然后使用TecanaiG220S-TWIN透射電子顯微鏡觀察和拍照。使用MalvernZetasizerNano-S粒度分析儀測定載藥納米膠囊的粒徑，并將膠囊稀釋100倍、200倍、500倍、1000倍后測定膠囊粒徑變化。5、納米紫杉醇荷載膠囊載藥量和緩釋的測定取1mL制備的載藥納米膠囊，加入2mL乙腈超聲溶脹后使用島津分光光度計測定229nm處吸光值，并結合紫杉醇濃度-吸光度標準曲線計算紫杉醇含量以及膠囊載藥量、包封率以及載藥濃度。載藥量=載藥膠囊中實際負載的PTX含量/膠囊質量，包封率=載藥膠囊中實際負載的PTX含量/反應加入的紫杉醇含量，載藥濃度=載藥膠囊中實際負載的PTX含量/膠囊溶液體積。取3mL制備的載藥納米膠囊裝入截留分子量為8000g/mol的透析袋，置于30mL含0.1%Twain80的PBS（pH7.4）溶液中透析，在0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h分別取樣200μL，使用戴安UltiMate3000PumPHPLC測定紫杉醇含量，并繪制緩釋曲線。6、納米紫杉醇荷載膠囊-TRAIL蛋白藥物對癌細胞殺傷效果檢測復蘇肝癌細胞株HepG2于DMEM完全培養基（含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素），在37℃、5%CO2條件下培養至對數生長期。胰酶消化，離心收集對數生長期HepG2細胞重懸于DMEM培養基，以8×103細胞/孔的密度接種于96孔板，每孔含細胞培養液100μL，在37℃、5%CO2條件下培養8h使細胞貼壁，加入10μL不同濃度的偶聯TRAIL載藥納米膠囊，共培養24h后加入10μLcck-8溶液，顯色反應1-4h后使用Bio-RAD酶標儀測定吸光值并計算細胞存活率。7、納米紫杉醇荷載膠本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種新型多功能靶向納米膠囊抗癌藥物的的分子設計與制備技術，其特征在于：該制備技術包括如下步驟：（1）嵌段共聚物F127的羧基化修飾將F127加入到無水甲苯中，攪拌至F127完全溶解，形成溶液A；向溶液A中加入與F127等重的丁二酸酐，攪拌后形成溶液B；將溶液B在150℃下沸浴加熱5h，減壓下蒸餾將甲苯蒸發，蒸餾后殘液用二氯甲烷洗滌，然后加入乙醚沉淀產物，產物用乙醚重結晶，最后得到F127?COOH；所述F127與無水甲苯的質量體積比為1:1，質量體積比單位為mg:ml；（2）載藥納米膠囊的制備稱取P123和F127?COOH超聲溶解于氯仿溶液，并加入紫杉醇或其它疏水性藥物，100?W超聲分散15?min，得到的混合溶液在75℃下真空干燥1?h以上，待氯仿完全蒸發完后得到一層納米薄膜，向薄膜內加入去離子水，200?W超聲分散12?min即得到包載紫杉醇的載藥納米膠束；取四甲氧基硅烷超聲分散于四氫呋喃溶液中，逐滴加入到載藥納米膠束中，并置于磁力攪拌儀上以750?rpm轉速攪拌3天，四甲氧基硅烷在膠束中水解形成一層二氧化硅殼，形成載藥納米膠囊；所述P123與F127?COOH的質量比為2:1?0.5,?紫杉醇與P123、F127?COOH混合物的質量比為1:70?300；所述的四甲氧基硅烷與四氫呋喃的用量為：四甲氧基硅烷與四氫呋喃的體積比為7:100，四甲氧基硅烷與載藥納米膠束的體積比為1:100?1000；（3）載藥納米膠囊與TRAIL蛋白的偶聯在磷酸鹽緩沖液（PBS）中加入1?(3?二甲氨基丙基)?3?乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N?羥基琥珀酰亞胺（NHS）以及載藥納米膠囊，室溫避光旋轉反應1?h活化膠囊表面的羧基；將反應后的溶液裝入截留分子量為8000?g/mol的透析袋，置于PBS溶液中透析24?h以除去未反應的EDC和NHS，再向透析后的溶液中加入TRAIL蛋白，4℃避光旋轉反應8?16?h，即得到偶聯TRAIL蛋白的載藥納米膠囊；所述磷酸鹽緩沖液、1?(3?二甲氨基丙基)?3?乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N?羥基琥珀酰亞胺、載藥納米膠囊的用量比為3:5:6:1,單位為ml:mg:mg:ml；所述TRAIL蛋白用量與載藥納米膠囊用量比為1:10?40；單位為mg:ml。...

【技術特征摘要】
1.一種新型多功能靶向納米膠囊抗癌藥物的的分子設計與制備技術，其特征在于：該制備技術包括如下步驟：（1）嵌段共聚物F127的羧基化修飾將F127加入到無水甲苯中，攪拌至F127完全溶解，形成溶液A；向溶液A中加入與F127等重的丁二酸酐，攪拌后形成溶液B；將溶液B在150℃下沸浴加熱5h，減壓下蒸餾將甲苯蒸發，蒸餾后殘液用二氯甲烷洗滌，然后加入乙醚沉淀產物，產物用乙醚重結晶，最后得到F127-COOH；所述F127與無水甲苯的質量體積比為1:1，質量體積比單位為mg:ml；（2）載藥納米膠囊的制備稱取P123和F127-COOH超聲溶解于氯仿溶液，并加入紫杉醇或其它疏水性藥物，100W超聲分散15min，得到的混合溶液在75℃下真空干燥1h以上，待氯仿完全蒸發完后得到一層納米薄膜，向薄膜內加入去離子水，200W超聲分散12min即得到包載紫杉醇的載藥納米膠束；取四甲氧基硅烷超聲分散于四氫呋喃溶液中，逐滴加入到載藥納米膠束中，并置于磁力攪拌儀上以750rpm轉速攪拌3天，四甲氧基硅烷在膠束中水解形成一層二氧化硅殼，形成載藥納米膠囊；所述P123與F127-COOH的質量比為2:1-0.5,紫杉醇...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王行國，劉欣，顧豪爽，李岳彬，
申請(專利權)人：湖北大學，
類型：發明
國別省市：湖北;42