用于高通量測序的DNA文庫構(gòu)建方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種擴(kuò)增子測序文庫的構(gòu)建方法，包括用多對融合引物對從待測樣品獲得的DNA模板進(jìn)行多重PCR，回收PCR產(chǎn)物，得到測序文庫；其中所述多對融合引物分別針對DNA模板上的不同目的片段，融合引物包含針對目的片段的特異性引物序列和測序接頭序列；其中多重PCR按下述反應(yīng)條件進(jìn)行：95℃2min；38個循環(huán)，每個循環(huán)為95℃30s，然后從76℃到55℃和58℃之間的任意溫度緩慢降溫，每秒降0.1℃，待降至58℃后保持20s，然后72℃30s；72℃2min，4℃保持。本發(fā)明專利技術(shù)還公開了該文庫構(gòu)建方法在高通量測序檢測STR基因座和親權(quán)鑒定中的應(yīng)用。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種用于高通量測序的DNA文庫構(gòu)建方法。
技術(shù)介紹
法醫(yī)DNA檢驗(yàn)技術(shù)的研究和分析對象主要是生物體內(nèi)DNA的多態(tài)性。一般來說，基因或非編碼區(qū)的DNA標(biāo)記在染色體上的位置稱為基因座，而位于同一個基因座上不同序列的基因被稱為等位基因。DNA多態(tài)性就是指作為遺傳標(biāo)記的基因座存在多個等位基因，分析基因座上等位基因的差異就是實(shí)現(xiàn)同一認(rèn)定的生物學(xué)基礎(chǔ)[1]。微衛(wèi)星DNA中的短串聯(lián)重復(fù)序列(shorttandemrepeats，STR)[2]是一種DNA多態(tài)性，廣泛存在于人類基因組的23對染色體上，通常由2-6bp的重復(fù)單位(或稱核心序列，coresequence)組成，不同個體(或等位基因)之間的差異一般只表現(xiàn)為重復(fù)單位的重復(fù)數(shù)目差異。STR基因座是一種重要的遺傳標(biāo)記，在多態(tài)性程度高的基因座上，其個體識別能力強(qiáng)，并且可以簡單地用PCR技術(shù)檢測出來，因而被廣泛應(yīng)用。STR基因座具有以下特點(diǎn)：STR多態(tài)性基因座數(shù)量多，片段長度一般小于400bp，易于擴(kuò)增，適于微量檢材的檢驗(yàn)；等位基因大小比較接近，較小等位基因優(yōu)先擴(kuò)增不明顯；不同位點(diǎn)的STR基因座片段長度差異較小，便于復(fù)合擴(kuò)增，提高檢測效率。STR基因座的分型檢驗(yàn)技術(shù)在法醫(yī)DNA檢驗(yàn)、親權(quán)鑒定中有著重要作用。我國大多數(shù)親權(quán)鑒定實(shí)驗(yàn)室都使用多基因座STR分型技術(shù)作為主要手段，對不同的STR基因座多態(tài)性進(jìn)行分析、比對并計算親權(quán)指數(shù)(PI值，即真父可能性與假父可能性的比值)。依據(jù)國際上多數(shù)實(shí)驗(yàn)室[3]采用的標(biāo)準(zhǔn)(PI值≥10000)作為區(qū)分是否“存在親生關(guān)系”的界線。傳統(tǒng)的STR分型技術(shù)多以PCR技術(shù)和毛細(xì)管電泳技術(shù)為基礎(chǔ)，使用熒光標(biāo)記的引物對樣品進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生不同大小的擴(kuò)增片段并在毛細(xì)管電泳中分離，從而實(shí)現(xiàn)分型，但這種方法通量較低，而且由于分析的對象是片段長度，無法進(jìn)一步檢測核酸一級結(jié)構(gòu)的微小差異，限制了檢測的分辨率，此外，在存在混合樣品時可能出現(xiàn)Stutter峰(片段分析時出現(xiàn)于主峰前的小峰)的干擾。而Sanger測序法由于通量、成本的原因，難以用于STR分型分析。二代高通量測序技術(shù)(NextGenerationSequencing)技術(shù)可以一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定，促進(jìn)了測序技術(shù)的高速發(fā)展。利用二代高通量測序技術(shù)可以對全基因組進(jìn)行測序。當(dāng)研究者只對特定的基因組區(qū)域感興趣的時候，可以利用擴(kuò)增子測序(AmpliconSequencing)方法只對相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行測序研究。通過設(shè)計感興趣的基因組區(qū)域的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行富集，然后針對特定長度的PCR產(chǎn)物或者捕獲的片段進(jìn)行建庫，高通量測序并進(jìn)行序列分析。目前的擴(kuò)增子測序都是通過常規(guī)的建庫方法，在通過PCR擴(kuò)增富集到目標(biāo)區(qū)域后，進(jìn)行混樣，然后進(jìn)行末端修復(fù)和加A，再加接頭，純化樣品，回收目的條帶，然后PCR擴(kuò)增，再跑膠回收主帶，這種常規(guī)的建庫方法步驟繁瑣、浪費(fèi)時間、工作量大，不利于大量樣品的測序建庫。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一種擴(kuò)增子測序文庫的構(gòu)建方法以及該文庫構(gòu)建方法在高通量測序檢測STR基因座中的應(yīng)用，該方法可以通過一次擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增子測序文庫的構(gòu)建，簡化建庫的操作過程，降低建庫的時間和成本，同時不影響測序質(zhì)量。根據(jù)本專利技術(shù)的一個方面，提供一種擴(kuò)增子測序文庫的構(gòu)建方法，包括用多對融合引物對從待測樣品獲得的DNA模板進(jìn)行多重PCR，回收PCR產(chǎn)物，得到測序文庫；其中所述多對融合引物分別針對DNA模板上的不同目的片段，每對融合引物從5'端到3'端依次包含測序接頭序列和針對目的片段的特異性引物序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，多重PCR按下述反應(yīng)條件進(jìn)行：95℃2min；38個循環(huán)，每個循環(huán)為95℃30s，然后從76℃到55℃和58℃之間的任意溫度緩慢降溫，每秒降0.1℃，待降至目的溫度后保持20s，然后72℃30s；72℃2min。本專利技術(shù)中，所述“多對融合引物”是指兩對、三對、或更多對融合引物。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，多重PCR按下述反應(yīng)條件進(jìn)行：95℃2min；38個循環(huán)，每個循環(huán)為95℃30s，然后從76℃到58℃緩慢降溫，每秒降0.1℃，待降至58℃后保持20s，然后72℃30s；72℃2min。在一些實(shí)施方案中，待測樣品包括但不限于血液、體液、唾液、精液、毛發(fā)、肌肉或組織器官。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，DNA模板是從待測樣品中提取的基因組DNA。本專利技術(shù)中，每對融合引物分別包含針對目的片段的特異性正向引物序列和反向引物序列。在一些實(shí)施方案中，測序接頭序列中包含index序列，以標(biāo)識不同的DNA模板，便于將不同樣品混合測序。本專利技術(shù)中融合引物中所包含的測序接頭序列可以是：上游引物中5'-CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3'，下游引物中5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-index序列-GAT-3'。本專利技術(shù)中融合引物中所包含的測序接頭序列還可以是：上游引物中5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-第一index序列-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'，下游引物中5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT+第二index序列+GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'。其中第一index序列與第二index序列是不同的index序列。在一些實(shí)施方案中，多重PCR反應(yīng)分1個或多個反應(yīng)體系來完成。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，一個反應(yīng)體系中包含兩個、三個、四個、或五個針對不同目的片段的融合引物對。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述目的片段是STR基因座。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，目的片段包括選自下述STR基因座的兩種或更多種STR基因座：CSF1PO(GenBankX14720)、FGA(GenBankM64982)、TH01(GenBankD00269)、TPOX(GenBankM68651)、D3S1358(NT_005997positions754983-755121)、D5S818(GenBankAC008512)、D7S820(GenBankAC004848)、D8S1179(GenBankAF216671)、D13S317(GenBankAL353628)、D16S539(GenBankAC024591)、D18S51(GenBankAP001534)、D21S11(GenBankAP000433)、D2S1338(GenBankAC010136)、CD4(GenbankM86525)、D12S391(GenbankM08921)、PLA2A1(GenbankM22970)、FABP(GenbankM18079)、D18S865(GenbankAC012289.12)和VWA(GenbankM25858)。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，目的片段包括下述所有STR基因座：CSF1PO(GenBankX14720)、FGA(GenBankM64982)、TH01(GenBankD00269)、TPOX(GenBankM68651)、D3S1358(NT_005997positions754983-755121)、D5S818(本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種擴(kuò)增子測序文庫的構(gòu)建方法，包括用多對融合引物對從待測樣品獲得的DNA模板進(jìn)行多重PCR，回收PCR產(chǎn)物，得到測序文庫；其中所述多對融合引物分別針對DNA模板上的不同目的片段，每對融合引物從5'端到3'端依次包含測序接頭序列和針對目的片段的特異性引物序列；其中多重PCR按下述反應(yīng)條件進(jìn)行：95℃2min；38個循環(huán)，每個循環(huán)為95℃30s，然后從76℃到55℃和58℃之間的任意溫度緩慢降溫，每秒降0.1℃，待降至目的溫度后保持20s，然后72℃30s；72℃2min。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種擴(kuò)增子測序文庫的構(gòu)建方法，包括用多對融合引物對從待測樣品獲得的DNA模板進(jìn)行多重PCR，回收PCR產(chǎn)物，得到測序文庫；其中所述多對融合引物分別針對DNA模板上的不同目的片段，每對融合引物從5'端到3'端依次包含測序接頭序列和針對目的片段的特異性引物序列；其中多重PCR按下述反應(yīng)條件進(jìn)行：95℃2min；38個循環(huán)，每個循環(huán)為95℃30s，然后從76℃到55℃和58℃之間的任意溫度緩慢降溫，每秒降0.1℃，待降至目的溫度后保持20s，然后72℃30s；72℃2min。2.權(quán)利要求1的構(gòu)建方法，其中DNA模板是從待測樣品中提取的基因組DNA。3.權(quán)利要求1的構(gòu)建方法，其中多重PCR反應(yīng)分1個或多個反應(yīng)體系完成...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王旭，鐘嘉泳，張弓，董鳴，余卓，
申請(專利權(quán))人：承啟醫(yī)學(xué)深圳科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：廣東;44