用于H5N8禽流感病毒檢測的試劑、檢測方法及應用技術

本申請公開了用于H5N8禽流感病毒檢測的試劑、檢測方法及應用。本申請用于H5N8禽流感病毒檢測的試劑，包括引物對和探針，探針在引物對擴增靶標區域內，引物對上游引物為Seq?ID?No.1所示序列，下游引物為Seq?ID?No.2所示序列，探針為Seq?ID?No.3所示序列或Seq?ID?No.3所示序列的反向互補序列。本申請的H5N8禽流感病毒檢測試劑，對禽流感亞種H5N8具有很強特異性，能夠準確靈敏的從眾多禽流感病毒中特異性檢出H5N8。基于本申請試劑的H5N8禽流感病毒檢測方法，耗時短，可很快作出判定結果，對于控制流感流行，減少經濟損失，最大限度保護社會人群健康和生命具有很大意義。

【技術實現步驟摘要】

本申請涉及禽流感病毒檢測領域，特別是涉及一種用于H5N8禽流感病毒檢測的試劑、檢測方法及應用。
技術介紹
禽流感是禽流行性感冒的簡稱，它是由甲型流感病毒的一種亞型(也稱禽流感病毒)引起的一種急性傳染病，也能感染人類，被國際獸疫局定為甲類傳染病。人感染后的癥狀主要表現為高熱、咳嗽、流涕、肌痛等，多數伴有嚴重的肺炎，嚴重者心、腎等多種臟器衰竭導致死亡，病死率很高，通常人感染禽流感死亡率約為33％。此病可通過消化道、呼吸道、皮膚損傷和眼結膜等多種途徑傳播。流感病毒屬正黏病毒科,由8條單股負鏈RNA構成基因組。流感病毒根據核心蛋白(NP)及基質(M)的抗原性不同，可分為A、B、C三型,其中致病性最強、在世界上流行最廣的是A型流感病毒。A型流感病毒根據表面糖蛋白凝血素(HA)的不同,可以分為15個亞型，H1-H15，根據表面糖蛋白神經氨酸酶(NA)的不同可以分為9個亞型N1-N9，因此理論上共有135種亞型組合。H5N8禽流感病毒是禽流感病毒的一種亞型。流感危害極大，變異極強，宿主范圍極廣，是傳播性極強的傳染病和人獸共患病，是WHO、FDA、OIE等國際組織聯合倡導全球共同防控的重大疫病。流感病毒有抗原漂移和抗原轉變的要求，變異性極大，不斷涌現新的病毒，近年來新型病毒出現的頻率明顯加大。1997年香港首次報道H5N1、H9N2感染人，2004年出現H5N1全球性流行，2013年3月在我國首先出現了H7N9型禽流感，2014年12月20日和2015年1月27新增83起人感染甲型H7N9禽流感病毒。H5N2禽流感在東亞多國──主要在越南、韓國、泰國──嚴重爆發，并造成越南多名病人喪生，中國河北省保定市首次發生H5N2禽流感疫情。2016年前后，廣東肇慶和深圳接連出現H5N6流感病例，深圳2例病例中，一人已經死亡。自2014年8月以來，中國境內廣東、湖南等12個省份家禽共發生新型H5N6高致病性禽流感25起，我國周邊日本、韓國、俄羅斯也均有H5N6發生流行，新出現的H5N6逐步代替H5N1而成為家禽和人群中的優勢流行毒株。2014年開始，H5N8開始在歐洲、亞洲和俄羅斯家禽中大規模流行，由于家禽與人的接觸關系密切，H5N8必然會傳染給人類。基于時效性和準確性上的優勢，實時熒光RT-PCR技術已經在疫病檢測的很多項目上逐步取代了一般RT-PCR方法，成為疫病檢測領域最常用的分子生物學方法。但是到目前為止，我國目前尚沒有比較有效的H5N8禽流感病毒的檢測試劑和方法的報道。
技術實現思路
本申請的目的是提供一種用于H5N8禽流感病毒檢測的試劑、檢測方法及應用。本申請采用了以下技術方案：本申請的一方面公開了一種用于H5N8禽流感病毒檢測的試劑，該試劑包括引物對和探針，探針在引物對的擴增靶標區域內，引物對的上游引物為SeqIDNo.1所示序列，引物對的下游引物為SeqIDNo.2所示序列，探針為SeqIDNo.3所示序列或者SeqIDNo.3所示序列的反向互補序列；SeqIDNo.1：5’-CTGCACATAAATACCCAACYCTGTA-3’SeqIDNo.2：5’-TGAGGAATGTTCTTGTTATCCAAATGA-3’SeqIDNo.3：5’-CCACTGTATCCCGACCAATT-3’SeqIDNo.1所示序列中，Y為C或者T堿基。需要說明的是，SeqIDNo.1所示序列中Y為簡并堿基，其可以為C或者T堿基。本申請中，探針為SeqIDNo.3所示序列或者SeqIDNo.3所示序列的反向互補序列，可以理解，在實時熒光檢測中，探針是特異性的結合到雙鏈的其中一條鏈的，只要PCR擴增的時候，將結合的探針破壞，即可產生熒光信號，因此，可以采用SeqIDNo.3所示序列的探針結合到其中一條鏈上，也可以采用SeqIDNo.3所示序列的反向互補序列作為探針結合到另一條鏈上。優選的，探針的5’端標記有HEX熒光基因，3’端標記有BHQ淬滅基團。本申請的另一面公開了本申請的用于H5N8禽流感病毒檢測的試劑在H5N8禽流感病毒檢測中的應用。本申請的另一面公開了本申請的用于H5N8禽流感病毒檢測的試劑在制備H5N8禽流感病毒檢測試劑盒或設備中的應用。可以理解，本申請的試劑，實際上就針對H5N8禽流感病毒設計的特異性探針和引物，當然可以用于H5N8禽流感病毒的檢測，或者用于H5N8禽流感病毒檢測的試劑盒或設備。本申請的另一面公開了一種用于H5N8禽流感病毒檢測的試劑盒，該試劑盒中含有本申請的用于H5N8禽流感病毒檢測的試劑。本申請的另一面公開了一種用于H5N8禽流感病毒檢測的試劑盒，該試劑盒中含有至少一組混合試劑，每組混合試劑由12.5μL2×realtimePCRBuffer、1μL25×enzymemix、終濃度0.4μM/L的引物對和終濃度0.2μM/L的探針組成；引物對的上游引物為SeqIDNo.1所示序列，引物對的下游引物為SeqIDNo.2所示序列，探針為SeqIDNo.3所示序列或者SeqIDNo.3所示序列的反向互補序列。需要說明的是，本申請的試劑實際上是針對H5N8禽流感病毒逆轉錄實時熒光PCR檢測而設計的，為了方便使用，本申請將反應體系中使用的buffer、酶、引物和探針統一配制成混合試劑，每一組混合試劑就是一個反應體系，直接向其中加入RNA樣品就可以進行檢測，使用簡單方便，不僅避免了配制反應體系的繁瑣步驟，而且避免了配制反應體系過程造成的污染。本申請的再一面還公開了一種H5N8禽流感病毒的逆轉錄實時熒光PCR檢測方法，包括以下步驟：(1)提取待測樣品的基因組RNA；(2)采用權利要求6所述的試劑盒，向所述混合試劑中加入步驟(1)提取的基因組RNA，配制成反應溶液；(3)將步驟(2)配制的反應溶液，在45℃反轉錄30min、95℃熱啟動10min，然后進入40個循環：95℃15s、60℃45s，在循環過程中于60℃時采集熒光。優選的，基因組RNA的提取采用RNA提取試劑盒，或者Trizol核酸抽提法。本申請的有益效果在于：本申請的用于H5N8禽流感病毒檢測的試劑，對禽流感亞種H5N8具有很強的特異性，能夠準確靈敏的從眾多禽流感病毒中特異性的檢測出H5N8，為新型H5N8禽病毒的檢測或監控提供了一種有效的方法和途徑。此外，基于本申請的試劑的H5N8禽流感病毒檢測方法，其耗時短，可以很快作出結果判定，這對于控制流感的流行，減少經濟損失，最大限度的保護全社會人群的健康和生命具有很大的意義。附圖說明圖1是本申請實施例中H5N8禽流感病毒逆轉錄實時熒光PCR檢測的特異性檢測結果；圖2是本申請實施例中H5N8禽流感病毒逆轉錄實時熒光PCR檢測的靈敏度檢測結果。具體實施方式下面通過具體實施例對本申請作進一步詳細說明。以下實施例僅對本申請進行進一步說明，不應理解為對本申請的限制。實施例一、反應體系的建立和優化利用人工合成的H5N8禽流感病毒的病毒質粒作為陽性標準品，其它供試樣本則利用商品化RNA提取試劑盒或Trizol核酸抽提試劑的提取方法提取病毒基因組RNA，分裝后置-20℃保存備用。其它供試樣本包括：H5N8滅活毒株、H5N1、H5N2、H9N2、新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、豬流感經典型H1N1毒株、豬流感本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于H5N8禽流感病毒檢測的試劑，其特征在于：所述試劑包括引物對和探針，所述探針在引物對的擴增靶標區域內，所述引物對的上游引物為Seq?ID?No.1所示序列，所述引物對的下游引物為Seq?ID?No.2所示序列，所述探針為Seq?ID?No.3所示序列或者Seq?ID?No.3所示序列的反向互補序列；Seq?ID?No.1：5’?CTGCACATAAATACCCAACYCTGTA?3’Seq?ID?No.2：5’?TGAGGAATGTTCTTGTTATCCAAATGA?3’Seq?ID?No.3：5’?CCACTGTATCCCGACCAATT?3’Seq?ID?No.1所示序列中，Y為C或者T堿基。

【技術特征摘要】
1.一種用于H5N8禽流感病毒檢測的試劑，其特征在于：所述試劑包括引物對和探針，所述探針在引物對的擴增靶標區域內，所述引物對的上游引物為SeqIDNo.1所示序列，所述引物對的下游引物為SeqIDNo.2所示序列，所述探針為SeqIDNo.3所示序列或者SeqIDNo.3所示序列的反向互補序列；SeqIDNo.1：5’-CTGCACATAAATACCCAACYCTGTA-3’SeqIDNo.2：5’-TGAGGAATGTTCTTGTTATCCAAATGA-3’SeqIDNo.3：5’-CCACTGTATCCCGACCAATT-3’SeqIDNo.1所示序列中，Y為C或者T堿基。2.根據權利要求1所述的用于H5N8禽流感病毒檢測的試劑，其特征在于：所述探針的5’端標記有HEX熒光基因，3’端標記有BHQ淬滅基團。3.根據權利要求1或2所述的用于H5N8禽流感病毒檢測的試劑在H5N8禽流感病毒檢測中的應用。4.根據權利要求1或2所述的用于H5N8禽流感病毒檢測的試劑在制備H5N8禽流感病毒檢測試劑盒或設備中的應用。5.一種用于H5N8禽流感病毒檢測的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中含有權利要求1或2所...

【專利技術屬性】
技術研發人員：秦智鋒，劉建利，唐金明，曾少靈，盧奕良，蔡良語，廖立珊，陳兵，馬嵐，孫潔，盧體康，陶虹，鄭曉聰，林慶燕，陳書琨，詹愛軍，蘭文升，曹琛福，王津津，
申請(專利權)人：深圳市檢驗檢疫科學研究院，深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心，清華大學深圳研究生院，
類型：發明
國別省市：廣東;44