用于在基因組中表征DNA序列組成的方法技術

本文公開了針對轉基因事件進行高通量分析的方法。所述方法使用經剪切的基因組DNA的文庫，其連接到專門的接頭并且合并以用于序列分析以及與已知基因組和插入序列的比較。所述方法可用于檢測表征插入位點、轉基因完整性，以及轉基因拷貝數。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及植物生物
更具體地講，本專利技術涉及確定植物基因組內的DNA序列組成的方法。對通過EFS-WEB作為文本文件提交的序列列表的引用遵照美國信息交換標準碼(AmericanStandardCodeforInformationInterchange(ASCII))，通過EFS-Web將序列表的正式文本作為文本文件與本說明書同時提交，文件名為431978seqlist.txt，創建日期為2013年4月17日，文件大小為2Kb。通過EFS-Web提交的序列表是說明書的一部分，藉此將其全文以引用的方式并入本文。
技術介紹
當含有所關注的靶序列的質粒轉化到植物中時，需要進行測試來確認轉化已發生并且評估轉化的質量。例如，當在已用相同構建體轉化的多個植物中選擇時，所選擇的植物應具有完整的所關注靶序列，該完整靶序列沒有重排、插入、缺失、或外源側翼序列。歷史上，Southern印跡方法已用于確認質粒構建體的轉化并且識別潛在的重排、多拷貝、或部分事件。Southern印跡實驗可為耗時的、提供低分辨率、具有高成本，并且需要多次手動檢查。此外，Southern印跡方法既不能識別靶序列整合位點，也不能識別整合位點的用于設計事件特異性PCR實驗的側翼序列。側翼序列分析(FSA)已成功地用于識別轉基因整合位點并且用于獲得插入位點的側翼序列。然而，由于FSA僅針對有限的邊界區域，因此FSA不檢測潛在的部分片段、重排、或超出目標邊界區域的截短。此外，由FSA使用的搜索算法可識別由質粒的參考序列中的任何誤差造成的假陽性。因此，一直需要迅速、低成本的方法來有效地表征插入植物基因組中的靶序列的位置、數量和完整性。
技術實現思路
基于測序的Southern(SbS)是整合的高通量序列和生物信息學分析流水線，其針對大規模事件選擇和推進決策而評估和表征轉化事件。SbS實施一系列過濾策略來確保檢測的精確度和靈敏度。通過用富集含有所關注的靶序列的片段的shotgun文庫開始，SbS可迅速過濾出內源讀數并且識別連接序列。連接序列被識別和延伸之后，接點被定位到植物基因組和靶序列構建體以確定插入序列的位置、數量和完整性。SbS可檢測小的部分片段并且容忍質粒的參考序列中的誤差。附圖說明圖1匯總了SbS數據分析流水線。圖2示出了來自識別染色體2上的所關注靶序列的單個插入的SbS流水線的輸出數據。圖3a和圖3b示出與靶序列片段的插入相鄰的靶序列的單個插入。靶序列插入與靶序列片段插入之間的接點被識別為構建體：構建體插入，而靶序列與植物基因組或者靶序列片段與植物基因組之間的接點被識別為構建體：基因組。圖4a和圖4b示出復雜插入事件，其中連接序列在染色體6和染色體9上被檢測到。靶序列在染色體9上的插入被復制并且處于相反方向。圖5識別靶序列的截短插入，證據是其不存在與農桿菌(Agrobacterium)構建體上的靶DNA的一部分對準的讀數。圖6識別農桿菌骨架的一部分插入到植物的基因組中。農桿菌骨架的插入可通過讀數(黑盒)與骨架的一部分的對準來識別。圖7a和圖7b描述了合成連接序列的方法。第一個表示出在合成步驟之前預測的推定接點。合成腳本根據相同取向中的每個接點的30_20聚體對所有接點支撐讀數進行分組。對于足夠接近的兩個接點(默認距離2bp)，如果30_20聚體在偏移距離后相同，則兩個接點冷凝成一個。如圖所示，兩個接點為11708和11709。在被合成之后，具有更多獨特支撐讀數的接點(接點11708)從接點11709接管支撐讀數。粗體的核苷酸表示單核苷酸多態性(SNP)并且列出的序列通過算法的分裂和合成特征來移除。具體實施方式借助前面的描述中給出的教導內容，本專利技術所屬領域的技術人員將會想到本文所述的專利技術的許多修改形式和其他實施例。因此，應當理解，本專利技術不限于所公開的特定實施例，并旨在將修改形式和其他實施例包括在所附權利要求的范圍內。雖然采用特定術語，但所述術語僅在一般性和描述性意義上使用而并非用于限制目的。對于商業產品批準的遺傳修飾的作物的表征目前需要轉基因DNA插入序列的詳細分子表征和轉基因基因座的完整性。此外，分子分析是產品開發過程中事件選擇和推進決策的重要組成部分。已知外來基因在植物中的表達受它們在植物基因組中的位置影響，這可能歸因于染色質結構(例如，異染色質)或轉錄調節元件(例如，增強子)接近整合位點的接近度(Weisingetal.(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477(Weising等人，1988年，《遺傳學年評》，第22卷，第421-477頁))。與此同時，轉基因在基因組中不同位置處的存在將以不同方式影響植物的總體表型。此外，插入轉基因的拷貝數可影響植物的表型。出于這個原因，經常需要篩選大量事件，以識別出以引入的所關注基因的最佳表達為特征的事件。例如，已經在植物及在其他生物體中觀察到，在事件之間可能存在引入基因的表達水平的巨大差異。在表達的空間或時間模式方面也可以存在差異，例如，轉基因在多種植物組織中相對表達方面的差異，這可能不對應于從存在于引入的基因構建體中的轉錄調節元件所預期的模式。因此，常見的是產生數百至數千個不同事件，并從這些事件中篩選出具有所需的轉基因表達水平和用于商業目的模式的單一事件。具有所需的轉基因表達水平或模式的事件可用于將轉基因通過有性遠交或其他常規育種方法漸摻至其他遺傳背景中。此類雜交的子代維持原始轉化體的轉基因表達特征。使用該雜交育種策略以在充分適應于局部生長條件的眾多品種中確保可靠的基因表達。通常，該分子分析依賴于Southern印跡以確定橫跨任何插入DNA的PCR產物的基因座和拷貝數以及靶標序列來完成表征過程。Southern印跡的缺點包括：低通量，每個樣品成本高，未知的序列組成和位置，以及檢測到的DNA片段缺乏完整性。最近，通過生物信息學的下一代(NextGen)測序和連接序列分析已在成本和時間上均優于Southern印跡分析。本專利技術涉及靶序列的擴增或捕獲，合并擴增或捕獲的序列以及通過DNA測序對合并樣品的表征。DNA序列數據被匯集并且與參考序列相比。轉基因插入的表征在植物、動物、和微生物物種，人類疾病診斷、靶序列的單個或多個拷貝的基因組位置、以及純度測試中是有用的。本專利技術進一步涉及植物的基因組中的所關注靶序列的生物信息學分析和表征的方法。當與本本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于在植物的基因組中表征靶序列的方法，所述方法包括：a)分離和純化基因組DNA的樣品；b)將所述基因組DNA剪切成片段以創建文庫；c)將所述文庫片段連接到具有條形碼的接頭序列；d)設計構建體特異性PCR引物，其中一種引物靶向插入序列，而第二PCR引物靶向所述接頭；其中所述引物被設計用于交替鏈上的每200個堿基對，或用于單鏈上的每400個堿基對；e)使用d)所述的PCR引物針對轉基因序列富集所述文庫；f)以相等摩爾比合并到樣品池中；g)對所述樣品池進行測序以獲得讀數；h)將所述讀數過濾并且與對照植物的所述基因組序列以及與所述所關注靶序列比對；i)選擇與所述所關注靶序列對齊的讀數；j)從所述所選擇的讀數確定連接序列；以及k)使用所述連接序列在所述樣品植物的所述基因組中表征所述所關注靶序列。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2013.04.17 US 61/812876;2013.04.17 US 61/8130011.一種用于在植物的基因組中表征靶序列的方法，所述方法包括：
a)分離和純化基因組DNA的樣品；
b)將所述基因組DNA剪切成片段以創建文庫；
c)將所述文庫片段連接到具有條形碼的接頭序列；
d)設計構建體特異性PCR引物，其中一種引物靶向插入序列，而
第二PCR引物靶向所述接頭；其中所述引物被設計用于交替鏈
上的每200個堿基對，或用于單鏈上的每400個堿基對；
e)使用d)所述的PCR引物針對轉基因序列富集所述文庫；
f)以相等摩爾比合并到樣品池中；
g)對所述樣品池進行測序以獲得讀數；
h)將所述讀數過濾并且與對照植物的所述基因組序列以及與所述所
關注靶序列比對；
i)選擇與所述所關注靶序列對齊的讀數；
j)從所述所選擇的讀數確定連接序列；以及
k)使用所述連接序列在所述樣品植物的所述基因組中表征所述所關
注靶序列。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述經剪切的基因組DNA片段在
約50個堿基對長度至約2.5kb長度的范圍內。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述經剪切的基因組DNA片段在
約200個堿基對長度至約1kb長度的范圍內；
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述經剪切的基因組DNA片段的
長度為約400個堿基對。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述PCR引物嵌套。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述PCR引物重疊。
7.根據權利要求1所述的方法，其中針對PCR偽影分析所述富集文
庫。
8.根據權利要求1所述的方法，其中所述富集步驟可使用來自所述插
入的兩個PCR引物。
9.根據權利要求1所述的方法，其中對步驟(g)中獲得的所述讀數進行
處理以移除任何接頭序列信息。
10.根據權利要求1所述的方法，其中步驟(g)中的測序產生至少100萬
讀數。
11.根據權利要求1所述的方法，其中所述讀數為100bp配對末端讀
數。
12.根據權利要求1所述的方法，其中選擇得自步驟(g)的所述前60％最
豐富的讀數以用于與對照植物的所述基因組序列以及與所述所關注
靶序列的比對。
13.根據權利要求1所述的方法，其中在步驟(j)中...

【專利技術屬性】
技術研發人員：M貝蒂，KR哈耶斯，JL霍夫曼，H林，GM扎斯特羅哈耶斯，
申請(專利權)人：先鋒國際良種公司，
類型：發明
國別省市：美國;US