基于環介導等溫擴增消光技術的轉基因水稻KF6檢測引物及檢測方法與試劑盒技術

本發明專利技術涉及分子生物學及生物檢測領域，具體公開了基于環介導等溫擴增消光技術的轉基因水稻KF6檢測引物及檢測方法與試劑盒。本發明專利技術針對轉基因水稻KF6轉化事件5’端基因的6個區域設計4條特異性引物，利用環介導等溫擴增消光技術使用所述引物對樣品的DNA進行擴增，通過判定反應顏色或吸光值的變化判斷是否有擴增產物，從而判斷是否存在轉基因水稻KF6。所述方法具有靈敏度高、特異性強、操作簡單、肉眼判定結果等優點，為轉基因水稻KF6檢測提供了有效、快速的檢測方法。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及分子生物學及生物檢測領域，具體地說，涉及基于環介導等溫擴增消光技術的轉基因水稻KF6檢測引物及檢測方法與試劑盒。
技術介紹
轉基因水稻KF6是中國自主研發的雙價抗蟲轉基因(抗蟲基因名稱:cry1Ac+SCK)水稻，目前已通過生產性試驗，具有良好的商業化前景。目前針對KF6的核酸檢測技術主要是定量PCR以及定量PCR，這兩種技術對儀器的依賴性比較高。此外還有利用重組酶聚合酶等溫擴增技術進行檢測的報道，但這種技術對試劑的依賴性太高，例如其中的重組聚合酶，并且通常情況下需要利用固定的試劑盒進行檢測，成本較高。環介導等溫擴增技術(Loop-mediatedisothermalamplificationmethod，LAMP)是Notomi等于2000年專利技術的一種新型的恒溫核酸擴增方法，其特點是針對靶基因的6個區域設計4-6條特異性引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(BstDNApolymerase)在等溫條件下(60-65℃)反應，在1h內即可完成核酸擴增反應，目的片段可以擴增109倍。該方法具有特異性強、靈敏度高、擴增效率高、省時、操作簡單等優點，在核酸檢測方面具有明顯優勢。目前環介導等溫檢測技術的產物檢測方法主要有濁度法、染料法、電泳法以及核酸試紙條，但是這些方法都容易引起交叉污染。
技術實現思路
為了解決現有技術中存在的問題，本專利技術的目的是提供基于環介導等溫擴增消光技術的轉基因水稻KF6檢測引物及檢測方法與試劑盒。該檢測方法操作簡便，不依賴昂貴儀器且對操作人員要求低，方法準確無污染。針對轉基因水稻KF6的轉化事件5’端基因檢測，可實現對待測樣品中轉基因水稻KF6成分的現場快速檢測。為了實現本專利技術目的，本專利技術的技術方案如下：第一方面，本專利技術針對轉基因水稻KF6轉化事件5’端為靶基因設計了基于環介導等溫擴增消光技術的轉基因水稻KF6檢測引物，所述引物包括上游外引物、下游外引物、上游內引物和下游內引物，序列分別為：上游外引物KF6-F3：CTGGGAGGGAGGGAGGGACCATGCTGCGATTCATG；下游外引物KF6-B3：CTGGGAGGGAGGGAGGGATCTTCATCCCTGGACTTG；上游內引物KF6-FIP：GAGTGACACGAATTCAACCTGACTGGGAGGGAGGGAGGGGCACTAAATCAATACCTCCT；下游內引物KF6-BIP：GGCTTGCAAATCCTGCATGCTGGGAGGGAGGGAGGGGTAACAGAAATCAGCAACGT。核酶是一種具有類過氧化物酶活性、富含鳥嘌呤的單鏈DNA分子，在特定的條件下能夠折疊成G4重結構，在H2O2存在下能夠催化無色底物2，2′-連氮基-雙-(3-乙基并二氫噻唑啉-6-磺酸)二價陰離子(ABTS2-)氧化成藍綠色物質ABTS-·自由基。當存在單鏈DNA分子的互補鏈時，這種類過氧化物酶的活性降低甚至消失。將折中顯色/消光技術結合到環介導等溫擴增技術上，利用引物顯色，產物消光的手段，來驗證目的片段的存在。本專利技術通過巧妙地設計引物，使引物既可高效擴增轉基因水稻KF6轉化事件5’端，又可作為具有類過氧化物酶活性單鏈DNA核酶，實現上述功能。第二方面，本專利技術提供了一種擴增效率高、準確度高的檢測轉基因水稻KF6的方法，即利用環介導等溫擴增消光技術用前述引物對樣品的DNA進行擴增，通過檢測是否有擴增產物來判斷是否存在轉基因水稻KF6轉化事件。有擴增產物時，判斷樣品中含有轉基因水稻KF6成分。具體包括如下步驟：(1)提取樣品基因組模板：將樣品磨成粉末，稱100mg±10mg樣品，用CTAB方法提取基因組；(2)顯色反應：將hemin工作液與前述引物混合，在35～45℃條件下孵育20～30min，添加ABTS顯色液和H2O2后得到顯色反應混合液，立刻判定顏色或通過紫外分光光度計在419nm處測定吸光值；(3)環介導等溫擴增消光反應：向顯色反應混合液中添加樣品基因組模板，在60～65℃進行環介導等溫擴增消光反應40～60min；(4)產物檢測：目視判定反應顏色，或通過紫外分光光度計在419nm處測定吸光值，通過與步驟(2)得到的顏色或吸光值進行比較，判斷是否有擴增產物。判定顏色由藍色變淺或變為無色，或者吸光值減小，可判定有目的擴增產物。作為優選，步驟(2)中，將40～60μM的hemin工作液與1.25μM的KF6-F3和KF6-B3以及10μM的KF6-FIP和KF6-BIP混合，在35～45℃條件下孵育20～30min，添加30～40mM的ABTS顯色液和50～60mM的H2O2后得到顯色反應混合液，立刻判定顏色或測定吸光值。為了更好的實現核酶的類過氧化物酶的活性，更為優選，向50μMhemin工作液中添加1.25μM外引物KF6-F3和KF6-B3，10μM內引物KF6-FIP和KF6-BIP，40℃孵育30min，然后添加36mMABTS顯色液和60mMH2O2，立即判定顏色，測定OD419。在該體系下進行顯色反應，能夠保證引物形成穩定的G4結構，與hemin最大程度結合，展現出更好的類過氧化物酶活性，在過氧化氫存在的條件下，最大程度的氧化ABTS底物。作為優選，步驟(3)中，向顯色反應混合液中添加1.4～2.0mMdNTP、3～8mMMgSO4、0.6～0.8M甜菜堿、3.6～10.0UBstDNA聚合酶大片段、1xThermopolbuffer，2μL樣品基因組模板，在60～65℃反應40～60min。反應所使用的儀器為水浴鍋或金屬浴。為了更好的實現后續環介導等溫擴增，更為優選，向顯色反應混合液中添加1.6mMdNTP、6mMMgSO4、0.8M甜菜堿，8.0UBstDNA聚合酶、1xThermopolbuffer。擴增反應程序：65℃反應40min，終止反應。在該體系下進行能夠保證引物的擴增效率不受影響，在短時間內實現快速擴增，保證盡可能多的核酶引物形成雙鏈產物，從而失去類過氧化物酶活性，使得反應體系消光。進一步地，hemin工作液由hemin溶于工作液配制，hemin的終濃度為40～60μM，優選50μM。ABTS顯色液是由ABTS粉劑溶于1XDMSO緩沖液配制，ABTS的終濃度為30～40mM，優選36mM，且現用現配。進一步地，所述工作液含有10mMNaH2PO4、100mMKCl、2mMMgCl2以及0.003％(w/w)TritonX-100，由ddH2O配置。第三方面，本專利技術提供了一種環介導等溫擴增消光技術檢測轉基因水稻KF6的試劑盒，所述試劑盒包括前述引物，工作液，hemin，ABTS粉劑，DMSO緩沖液，30％(w/w)H2O2，以及1xThermopolbuffer、dNTP、MgSO4、甜菜堿組成的反應液和BstDNA聚合酶；所述工作液含有10mMNaH2PO4、100mMKCl、2mMMgCl2以及0.003％TritonX-100。作為優選，所述反應液是由體積比為5:8:1:10的1xThermopolbuffer、1.4～2.0mMdNTP、3～8mMMgSO4和0.6～0.8M甜菜堿組成。在所述試劑盒中，所述引物以引物混合液的形式存在，所述引物混合液中含有1.2本文檔來自技高網...

【技術保護點】
基于環介導等溫擴增消光技術的轉基因水稻KF6檢測引物，其特征在于，所述引物包括上游外引物、下游外引物、上游內引物和下游內引物，序列分別為：上游外引物KF6?F3：CTGGGAGGGAGGGAGGGACCATGCTGCGATTCATG；下游外引物KF6?B3：CTGGGAGGGAGGGAGGGATCTTCATCCCTGGACTTG；上游內引物KF6?FIP：GAGTGACACGAATTCAACCTGACTGGGAGGGAGGGAGGGGCACTAAATCAATACCTCCT；下游內引物KF6?BIP：GGCTTGCAAATCCTGCATGCTGGGAGGGAGGGAGGGGTAACAGAAATCAGCAACGT。

【技術特征摘要】
1.基于環介導等溫擴增消光技術的轉基因水稻KF6檢測引物，其特征在于，所述引物包括上游外引物、下游外引物、上游內引物和下游內引物，序列分別為：上游外引物KF6-F3：CTGGGAGGGAGGGAGGGACCATGCTGCGATTCATG；下游外引物KF6-B3：CTGGGAGGGAGGGAGGGATCTTCATCCCTGGACTTG；上游內引物KF6-FIP：GAGTGACACGAATTCAACCTGACTGGGAGGGAGGGAGGGGCACTAAATCAATACCTCCT；下游內引物KF6-BIP：GGCTTGCAAATCCTGCATGCTGGGAGGGAGGGAGGGGTAACAGAAATCAGCAACGT。2.一種檢測轉基因水稻KF6的方法，其特征在于，利用環介導等溫擴增消光技術用權利要求1所述的引物對樣品的DNA進行擴增，通過檢測是否有擴增產物來判斷是否存在轉基因水稻KF6轉化事件。3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)提取樣品基因組模板；(2)顯色反應：將hemin工作液與權利要求1所述引物混合，在35～45℃條件下孵育20～30min，添加ABTS顯色液和H2O2后得到顯色反應混合液，立刻判定顏色或通過紫外分光光度計在419nm處測定吸光值；(3)環介導等溫擴增消光反應：向顯色反應混合液中添加樣品基因組模板，在60～65℃進行環介導等溫擴增消光反應40～60min；(4)產物檢測：目視判定反應顏色，或通過紫外分光光度計在419nm處測定吸光值，通過與步驟(2)的結果比較，判斷是否有擴增產物。4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，將40～60μM的hemin工作液與1.25μM的KF6-F3和KF6-B3以及10μM的KF6-FIP和KF6-...

【專利技術屬性】
技術研發人員：羅云波，黃昆侖，許文濤，徐瑗聰，張莉，
申請(專利權)人：中國農業大學，
類型：發明
國別省市：北京;11