使用外源單鏈RNA在卷枝毛霉休眠孢子中表達蛋白質的方法技術

本發明專利技術公開了一種使用外源單鏈RNA在卷枝毛霉休眠孢子中表達蛋白質的方法，包括卷枝毛霉培養和孢子收集、卷枝毛霉孢子預處理以及使用HDEN法電擊卷枝毛霉孢子三個步驟，該方法繞過真菌孢子萌發這個步驟，采用HDEN電轉化技術，將體外的單鏈編碼蛋白RNA遞送穿過細胞壁和細胞膜，在卷枝毛霉休眠孢子內表達蛋白質。本發明專利技術方法步驟簡便快速，效果極佳，轉化率達到90%以上。

The use of exogenous protein expression in single strand RNA method of Mucor circinelloides in resting spores

The invention discloses a method for protein expression of exogenous single strand RNA in Mucor circinelloides dormant spores, including Mucor circinelloides culture and spore collection, Mucor circinelloides spores pretreatment using HDEN method and shock of Mucor circinelloides spores in three steps, the method of fungal spore germination to bypass this step, using HDEN transformation technology will be a single encoding protein RNA in vitro delivery through the cell wall and cell membrane, in Mucor circinelloides resting spores in protein expression. The method of the invention has the advantages of simple and rapid process, excellent effect and high conversion rate of more than 90%.

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物
，具體涉及使用外源單鏈RNA在卷枝毛霉休眠孢子中表達蛋白質的方法。
技術介紹
分子生物學的中心法則是指遺傳信息從DNA傳遞給RNA，再從RNA傳遞給蛋白質，即完成遺傳信息的轉錄和翻譯的過程。現代基因工程中，常常使用宿主來表達外源蛋白，常用的做法就是構建質粒載體，把外源蛋白的編碼DNA序列放在一個強啟動子后面，導入宿主細胞后，編碼DNA序列被轉錄成mRNA序列(單鏈RNA)，mRNA序列又被細胞內的翻譯機器表達成蛋白質分子，完成外源蛋白表達的全過程。DNA不論是作為游離于宿主基因組之外的質粒，還是插入到宿主基因組之中，都可以穩定地復制自身，并傳遞給子代。也就是說，DNA的信息可以遺傳。同時，DNA可以源源不斷地轉錄出新生RNA，并翻譯成蛋白質。RNA由核糖核苷酸經磷酸二酯鍵縮合而成長鏈狀分子。一個核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和堿基構成。RNA的堿基主要有4種，即A(腺嘌呤)、G(鳥嘌呤)、C(胞嘧啶)、U(尿嘧啶)。RNA作為單鏈分子，與雙鏈結構的DNA相比，RNA很不穩定，半衰期很短，而且在自然界，RNA酶廣泛存在，RNA非常容易被降解。RNA具有以下眾所周知的特征：游離在細胞質的RNA不會遺傳；RNA半衰期很短，不能長期存在；RNA不會插入到宿主的基因組DNA中。由于半衰期短，因此，一個RNA分子存在于細胞內的時長，也很短暫，該RNA只能在這個短暫的時間內，與核糖體相互作用，表達蛋白質分子。而被表達出來的蛋白質分子，也是有壽命的，一個蛋白質分子在細胞內存在多久，也可以用半衰期指標來衡量。在傳統的基因工程技術中，如果要在一個宿主細胞內部表達外源的蛋白質，常用的做法是把蛋白質的編碼基因構建在DNA載體上，把DNA載體轉入宿主細胞內部，DNA載體源源不斷地轉錄出編碼蛋白質的RNA，RNA不斷翻譯出目的蛋白，實現了在細胞內的蛋白表達。如果不借助DNA載體，在體外制備編碼蛋白的單鏈RNA分子，僅僅把編碼蛋白質的外源單鏈RNA導入到宿主細胞內部，只要細胞內沒有對應的DNA源源不斷地轉錄出新的該RNA，那么，這個RNA與其所表達出的蛋白質分子，只能在特定的時間窗口存在。換言之,這個RNA與其所表達出的蛋白質分子，只能在細胞生命周期中的某一個時間段存在。因此，這個特性有個很重要的作用，可以在特定的時間周期窗口，瞬時表達某個蛋白或者RNA，可以實現表達蛋白質而不影響或者盡可能少影響細胞的正常生理周期和遺傳信息。比如：可以在細胞生命活動的某個時間節點，轉入外源RNA，表達某個細胞因子，調控細胞的生命周期；可以把TALENs、ZFNs和CRISPR/Cas9等GenomeEditing的工具酶蛋白分子，用外源單鏈RNA在宿主細胞內做表達，避免使用質?；蚱渌麯NA形式的載體時，將DNA序列引入細胞內部，并造成潛在的外源DNA與宿主染色體相互作用(例如同源重組)，影響細胞的遺傳，等等。這個特性在基因工程領域，具有重要價值。在哺乳動物細胞實驗中，已經有先例，可以把外源單鏈RNA直接轉入哺乳動物細胞中。主要方法包括：1，使用諸如Lipo等試劑的化學法，Lipo等化學試劑可以與哺乳動物細胞的細胞膜發生相互作用，把外源RNA導入細胞內部。2，傳統的電轉化法，比如方波電擊，這是一種用電脈沖短暫作用于接觸外源RNA的哺乳動物細胞，使外源RNA進入細胞。卷枝毛霉是一種工業發酵菌種，可以生產降粘酶等各種重要的工業產品。為了對其進行基因工程開發，需要在其細胞內表達外源蛋白，但是在這種真菌未萌發孢子中表達蛋白質非常困難。真菌孢子是真菌的主要繁殖器官，孢子呈休眠狀態且可以生存很長時間。孢子在適宜的外界條件下，能夠蘇醒并萌發，形成菌絲而進行分裂繁殖。最為重要的是，很多類型真菌的孢子，是天然的單倍體，孢子是基因工程領域良好的起始生物材料。但是，由于孢子一般處于休眠狀態，其細胞壁非常厚實，休眠孢子的細胞壁、細胞膜的狀態，與萌發孢子、與菌絲體是不同的。且休眠孢子細胞內的生命活動也處于最不旺盛的狀態，因此，本領域公知，休眠孢子的細胞通透性不如萌發孢子和菌絲，休眠孢子幾乎不與外界交流物質，閉關鎖國，一般處于睡眠狀態。而萌發孢子或菌絲體，需要從外界吸收各種營養分子供給生命活動，因此細胞壁和細胞膜的通透性大于休眠孢子。所以，非常難以將外源RNA分子直接導入到睡眠孢子的內部。目前也尚未有任何方法可以做到直接把外源RNA分子在無介質介導的情況下，導入休眠的(未萌發)真菌孢子內部。這也是本行業內一直沒有攻克的技術難題。目前尚未有把外源單鏈RNA導入卷枝毛霉細胞內部的報道，更沒有把外源RNA導入卷枝毛霉孢子(無論是萌發孢子，還是未萌發孢子)的報道。目前用基因工程技術在卷枝毛霉細胞內表達目的蛋白質的方法，仍然需要借助DNA載體，且一般需要使用卷枝毛霉成熟菌絲體的原生質體作為宿主細胞，或者借助農桿菌作為介質，用DNA載體運載基因信息進入宿主細胞。此外，編碼蛋白質的外源RNA導入未萌發孢子內部后，還需要與孢子內部的蛋白翻譯因子等各種細胞因子、酶系相互作用，才能翻譯出蛋白質分子。但是，眾所周知，睡眠孢子的生命活動處于最不旺盛的狀態，細胞內各種蛋白翻譯因子和酶系的活力是很低的，各種因子和酶系分子的數量也是很少的，即便外源RNA進入了未萌發孢子內部，也需要比較長的相互作用時間，才能翻譯出目的蛋白。而時間長，就意味著外源RNA在細胞內，被細胞內源性RNA酶降解的概率加大，因此，就要求要有足夠多數量的外源RNA，可以進入未萌發孢子內部。如何讓真菌的孢子萌發，本領域已經有現成的技術方案，但是無論哪種萌發方法，都需要消耗時間、精力、人工操作、以及化學試劑。業內已經有用萌發的真菌孢子，導入外源DNA的案例，因此，按照本領域的基礎理論，一般認為，用細胞通透性更強的萌發孢子導入外源分子(例如外源的RNA)的成功率更大，因為萌發的孢子已經蘇醒，細胞內各種因子和酶系已經充分調動和活躍起來了，細胞要吸收養分，細胞內外物質交流活躍。可惜的是，目前為止，尚未有用孢子(無論是萌發還是未萌發)導入外源編碼RNA的先例。但是，顯而易見，用未萌發的孢子來作為導入外源分子的起始材料，非常簡便，因為可以省去做孢子萌發這一復雜的步驟，更重要的是，萌發的孢子，可能已經產生了多倍體，而未萌發的孢子，可以保證是單倍體，很多基因工程的應用，要求宿主細胞必須是單倍體，才能達到預想的結果或者效率。因此本專利技術嘗試繞過真菌孢子萌發這個步驟，直接用休眠的孢子，來導入外源RNA。另外，眾所周知真菌能產生大量的RNA酶，并且能夠大量外分泌這些RNA酶，真菌是自然界RNA酶的主要來源之一。真菌孢子采集自菌體，采集真菌孢子時，孢子會攜帶有菌體分泌的大量的外源性RNA酶，而且很難在不殺滅孢子的情況下，把RNA酶徹底清洗干凈(如果使用DEPC等化合物來做徹底清洗，勢必會殺滅真菌孢子)。而且孢子自身也會產生和外分泌一些RNA酶。因此，使用外源單鏈RNA來轉化真菌細胞，非常困難，無異于雞蛋碰石頭，單鏈RNA還未接觸到真菌細胞就會被RNA酶降解了。綜上所述，將編碼蛋白質的RNA分子，直接導入真菌(無論是菌絲體還是孢子，無論是萌發的孢子還是未萌發的孢子)內部，是本行業內一直沒有攻克的技術難題。電擊轉化(Electr本文檔來自技高網...

【技術保護點】
使用外源單鏈RNA在卷枝毛霉休眠孢子中表達蛋白質的方法，其特征在于：所述方法包括以下步驟：1）卷枝毛霉培養和孢子收集在固體瓊脂培養基表面接種卷枝毛霉，培養至培養基表面長滿卷枝毛霉孢子，洗下培養基表面的卷枝毛霉孢子，吸出孢子懸液并過濾去除菌絲，收集含有孢子的濾液，將濾液離心，收集沉淀的休眠孢子；2）卷枝毛霉孢子預處理用電擊緩沖液重懸孢子，離心并收集孢子沉淀，重復上述重懸和離心步驟3?4次后，將最后收集的孢子沉淀重懸于電擊緩沖液中，得到孢子濃度為104?1011個/ml的卷枝毛霉孢子懸液；所述電擊緩沖液由終濃度為0.01?100mmol/L的4?羥乙基哌嗪乙磺酸和終濃度為0.5?5000mmol/L的甘露醇組成，電擊緩沖液的pH為3.0?9.5；3）使用HDEN法電擊卷枝毛霉孢子在細胞培養板的孔中加入上述步驟得到的卷枝毛霉孢子懸液以及待轉化RNA，混勻，得到孢子與RNA混合物，將細胞培養板置于冰上冰浴10?15min，然后采用Etta?Biotech?X?Porator?H1電轉儀進行HDEN法電擊，將帶有矩陣式電極的電擊頭插入孢子與RNA混合物內部，通電，使得孢子與RNA混合物內部產生電場，電擊之后再將細胞培養板置于冰上冰浴10?15min，然后將孢子和RNA混合物吸出，得到導入外源RNA的休眠的卷枝毛霉孢子；所述卷枝毛霉懸液與待轉化RNA的比例為：0.6?60000μl的卷枝毛霉孢子懸液：0.1?10000μg的待轉化RNA；所述電擊參數如下：電壓1?6000V，脈寬2?2000000ms，重復1?100次，每次間隔5?50000ms。...

【技術特征摘要】
1.使用外源單鏈RNA在卷枝毛霉休眠孢子中表達蛋白質的方法，其特征在于：所述方法包括以下步驟：1）卷枝毛霉培養和孢子收集在固體瓊脂培養基表面接種卷枝毛霉，培養至培養基表面長滿卷枝毛霉孢子，洗下培養基表面的卷枝毛霉孢子，吸出孢子懸液并過濾去除菌絲，收集含有孢子的濾液，將濾液離心，收集沉淀的休眠孢子；2）卷枝毛霉孢子預處理用電擊緩沖液重懸孢子，離心并收集孢子沉淀，重復上述重懸和離心步驟3-4次后，將最后收集的孢子沉淀重懸于電擊緩沖液中，得到孢子濃度為104-1011個/ml的卷枝毛霉孢子懸液；所述電擊緩沖液由終濃度為0.01-100mmol/L的4-羥乙基哌嗪乙磺酸和終濃度為0.5-5000mmol/L的甘露醇組成，電擊緩沖液的pH為3.0-9.5；3）使用HDEN法電擊卷枝毛霉孢子在細胞培養板的孔中加入上述步驟得到的卷枝毛霉孢子懸液以及待轉化RNA，混勻，得到孢子與RNA混合物，將細胞培養板置于冰上冰浴10-15min，然后采用EttaBiotechX-PoratorH1電轉儀進行HDEN法電擊，將帶有矩陣式電極的電擊頭插入孢子與RNA混合物內部，通電，使得孢子與RNA混合物內部產生電場，電擊之后再將細胞培養板置于冰上冰浴10-15min，然后將孢子和RNA混合物吸出，得到導入外源RNA的休眠的卷枝毛霉孢子；所述卷枝毛霉懸液與待轉化RNA的比例為：0.6-60000μl的卷枝毛霉孢子懸液：0.1-10000μg的待轉化RNA；所述電擊參數如下：電壓1-6000V，脈寬2-2000000ms，重復1-100次，每次間隔5-50000ms。2.根據權利要求1所述的使用外源單鏈RNA在卷枝毛霉休眠孢子中表達蛋白質的方法，其特征在于：所述步驟1）的培養基為PDA培養基、YPD培養基或察氏培養基。3.根據權利要求1所述的使用外源單鏈RNA在卷枝毛霉休眠孢子中表達蛋白質的方法，其特征在于：所述步驟1，）卷枝毛霉的培養條件為：溫度16-40℃，濕度15-85%，培養3-15日。4.根據權利要求1所述的使用外源單鏈RNA在卷枝毛霉休眠孢子中表達蛋白質的方法，其特征在于：所述步...

【專利技術屬性】
技術研發人員：林峻，
申請(專利權)人：福州大學，
類型：發明
國別省市：福建;35