一種超表達內源性溶菌酶的菌株的構建方法及構建的菌株與應用技術

本發明專利技術公開了一種超表達內源性溶菌酶的菌株的構建方法，步驟如下：首先構建內源性溶菌酶的超表達載體，然后將超表達載體通過接合轉移轉入至出發菌株中，篩選得到內源性溶菌酶超表達的基因工程菌。本發明專利技術采用超表達技術，通過高表達內源性溶菌酶基因，改善工業菌株的細胞通透性，增強營養物質的攝取和次級代謝產物的分泌效率，最終提高了代謝產物的表達水平。本發明專利技術首次提出將該菌株的構建方法應用于工業微生物的菌種改造，為微生物育種提供了一條全新的方法。

Construction method of strain for overexpression of endogenous lysozyme and strain and application thereof

The invention discloses a construction method, a super expression of endogenous lysozyme strain steps are as follows: firstly construct the expression vector of endogenous lysozyme, then the expression vector by conjugation into the starting strains, screening of gene engineering bacteria obtained over expression of endogenous lysozyme. The invention adopts ultra high expression technology, through the endogenous expression of lysozyme gene, improve industrial strain cell permeability, enhance the efficiency of nutrient uptake and secretion of secondary metabolites, and ultimately improve the expression level of metabolites. The invention is the first time that the construction method of the strain is applied to the transformation of the strain of the industrial microorganism, which provides a new method for the microbial breeding.

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于微生物育種和生物
，具體涉及一種超表達內源性溶菌酶的菌株的構建方法及構建的菌株，及其在工業微生物的菌種改造中的應用。
技術介紹
溶菌酶又稱胞壁質酶或N-乙酰胞壁質聚糖水解酶，廣泛存在于高等動物組織及分泌物、植物及各種微生物中。溶菌酶具有抗菌、抗病毒和消炎作用，與抗生素復合應用能增強抗生素療效。它還是人體內的非特異性免疫因子，可提高機體的免疫力，并且與其他陽離子抗菌肽類天然防御因子具有很好的協同作用。目前溶菌酶已廣泛應用于各種加工食品和飲料中，集藥理、保健和防腐為一體，具有廣泛的應用價值。但目前尚未有通過調節溶菌酶的表達來用于微生物育種的報道。對于微生物育種而言，目前所涉及的育種方法主要有誘變育種技術、定向進化育種技術和基因工程改造等，以棒狀鏈酶菌為例，克拉維酸是由棒狀鏈霉菌(Streptomycesclavuligerus)合成的一種次級代謝產物，是臨床上常用的β-內酰胺酶抑制劑，可與阿莫西林或替卡西林聯合用藥，用于治療耐藥性致病菌感染，具有重要的臨床價值。棒狀鏈霉菌的發酵水平是決定克拉維酸生產成本的重要因素，因此選育克拉維酸高產菌株具有重要的工業價值。多種新型育種方法已經在棒狀鏈霉菌育種工作中得到應用，比如報告基因輔助的誘變育種技術、定向進化育種技術和基因工程改造等，但是這些技術都集中在對克拉維酸合成基因和調控基因的改造上，希望通過提高克拉維酸合成酶或正調控基因的表達水平，或通過增強克拉維酸合成酶活性進而提高克拉維酸的合成效率。但是由于克拉維酸屬于次級代謝產物，其合成途徑受到廣泛的調控，僅改造單個或數個基因往往無法預料整個代謝流向的改變，影響理想高產菌株的獲得。因此，開發一種新的棒狀鏈霉菌的改造方法，并獲得高產克拉維酸的菌株具有非常重要的實際應用價值。
技術實現思路
針對上述現有技術，本專利技術的目的是提供一種超表達內源性溶菌酶的菌株的構建方法及其在工業微生物菌種改造中的應用。本專利技術的另一目的是提供一株超表達內源性溶菌酶的棒狀鏈霉菌及其構建方法。本專利技術不直接改造克拉維酸的合成基因或調控基因，而是通過提高內源性溶菌酶的表達量來增強細胞通透性，進而提高底物攝取效率和克拉維酸產量。為實現上述目的，本專利技術采用如下技術方案：本專利技術的一個方面涉及一種超表達內源性溶菌酶的菌株的構建方法。本專利技術提供的方法，包括如下步驟：首先構建內源性溶菌酶的超表達載體，然后將超表達載體通過接合轉移轉入至出發菌株中，篩選得到內源性溶菌酶超表達的基因工程菌。本專利技術通過上述構建方法提高了菌株內源性溶菌酶活性，進而增強細胞通透性和產物合成效率。上述菌株的構建方法在工業微生物菌種改造中的應用也是本專利技術的保護范圍。所述工業微生物菌種改造是指提高工業微生物代謝產物的合成量。本專利技術的另一方面涉及一種超表達內源性溶菌酶的棒狀鏈霉菌的構建方法，包括如下步驟：以生產克拉維酸的棒狀鏈霉菌菌株作為出發菌株，構建內源性溶菌酶的超表達載體，然后將超表達載體通過接合轉移轉入至出發菌株中，篩選得到內源性溶菌酶超表達的基因工程菌。所述超表達載體的構建方法為：采用PCR克隆棒狀鏈霉菌的內源性溶菌酶基因，將PCR產物用XbaI和BamHI進行酶切，凝膠瓊脂糖電泳分離后回收酶切產物，并與同樣酶切的穿梭載體pHZ1272進行連接，轉化大腸桿菌DH5a，挑取轉化子提取質粒進行酶切鑒定。優選的，所述內源性溶菌酶基因為帶有強啟動子的內源性溶菌酶基因SCN_RS20110。PCR克隆所采用的引物為：上游引物：GCTCTAGAATGACCACTTCCAGATACTCT；(SEQIDNO.1)下游引物：GCGAATTCTCAGCCGTTGGCGAGTGCCAC。(SEQIDNO.2)PCR克隆所采用的擴增體系為：棒狀鏈霉菌基因組DNA2μl、PCR緩沖液5μl、高保真DNA聚合酶1μl、dNTP2μl、上游引物2μl、下游引物2μl，補加超純水至50μl。PCR克隆所采用的擴增條件為：97℃預變性10分鐘；97℃變性30秒，62℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，循環28次；終延伸8分鐘。本專利技術的再一方面涉及一株超表達內源性溶菌酶的棒狀鏈霉菌，該菌株為棒狀鏈霉菌(Streptomycesclavuligerus)LY6，已于2016年8月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏編號為CGMCCNO.12830。該棒狀鏈霉菌(Streptomycesclavuligerus)LY6，是以棒狀鏈霉菌工業菌株B02作為出發菌株，采用上述超表達內源性溶菌酶的棒狀鏈霉菌的構建方法而構建得到。進一步的，本專利技術還提供一種菌劑，該菌劑的活性成分為棒狀鏈霉菌(Streptomycesclavuligerus)LY6。上述棒狀鏈霉菌(Streptomycesclavuligerus)LY6和/或上述菌劑在制備克拉維酸中的應用也是本專利技術的保護范圍。進一步的，上述棒狀鏈霉菌(Streptomycesclavuligerus)LY6和/或上述菌劑在制備β-內酰胺酶抑制劑中的應用也是本專利技術的保護范圍。本專利技術的有益效果：(1)本專利技術首次提供了一種超表達內源性溶菌酶菌株的構建方法，采用超表達技術，通過高表達內源性溶菌酶基因，改善工業菌株的細胞通透性，增強營養物質的攝取和次級代謝產物的分泌效率，最終提高了代謝產物的表達水平。本專利技術并且首次提出將該菌株的構建方法應用于工業微生物的菌種改造，為微生物育種提供了一條全新的方法。(2)通過采用本專利技術的菌株構建方法，本專利技術構建得到了一株超表達內源性溶菌酶的棒狀鏈霉菌，發酵驗證發現，采用本專利技術方法構建的棒狀鏈霉菌，其克拉維酸發酵水平比出發菌株高1.5倍以上，可應用于工業化發酵生產，具有重要的經濟價值。(3)本專利技術通過改善工業菌株的細胞通透性來提高目標產物的發酵水平，針對性非常強，符合工業生產菌株的育種需要，易于在其他工業微生物菌種的育種改造中推廣應用。附圖說明圖1：Real-timePCR分析內源性溶菌酶的轉錄水平差異；圖2：克拉維酸發酵水平比較。具體實施方式結合實施例對本專利技術作進一步的說明，應該說明的是，下述說明僅是為了解釋本專利技術，并不對其內容進行限定。實施例1：內源性溶菌酶基因的超表達重組菌株的構建采用PCR克隆棒狀鏈霉菌的內源性溶菌酶基因(內源性溶菌酶基因帶有強啟動子的內源性溶菌酶基因SCN_RS20110)，構建到鏈霉菌超表達載體pHZ1272中(pHZ1272為常規的市售質粒載體)。PCR的引物為：上游引物LYSForward序列是GCTCTAGAATGACCACTTCCAGATACTCT(SEQIDNO.1)；下游引物LYSReverse序列是GCGAATTCTCAGCCGTTGGCGAGTGCCAC(SEQIDNO.2)。PCR體系：棒狀鏈霉菌基因組DNA2μl、PCR緩沖液5μl、高保真DNA聚合酶1μl、dNTP2μl、上游引物2μl、下游引物2μl，補加超純水至50μl。PCR條件：預變性97℃10分鐘，變性97℃30秒，退火62℃30秒，延伸72℃1分鐘，循環28次，終延伸8分鐘。將PCR產物用XbaI和BamHI進行雙酶切，凝膠瓊脂糖電泳本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種超表達內源性溶菌酶的菌株的構建方法，其特征在于，步驟如下：首先構建內源性溶菌酶的超表達載體，然后將超表達載體通過接合轉移轉入至出發菌株中，篩選得到內源性溶菌酶超表達的基因工程菌。

【技術特征摘要】
1.一種超表達內源性溶菌酶的菌株的構建方法，其特征在于，步驟如下：首先構建內源性溶菌酶的超表達載體，然后將超表達載體通過接合轉移轉入至出發菌株中，篩選得到內源性溶菌酶超表達的基因工程菌。2.權利要求1所述的菌株的構建方法在工業微生物菌種改造中的應用。3.一種超表達內源性溶菌酶的棒狀鏈霉菌的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：以生產克拉維酸的棒狀鏈霉菌作為出發菌株，構建內源性溶菌酶的超表達載體，然后將超表達載體通過接合轉移轉入至出發菌株中，篩選得到內源性溶菌酶超表達的基因工程菌。4.如權利要求3所述的構建方法，其特征在于，所述超表達載體的構建方法為：采用PCR克隆棒狀鏈霉菌的內源性溶菌酶基因，將PCR產物用XbaI和BamHI進行酶切，凝膠瓊脂糖電泳分離后回收酶切產物，并與同樣酶切的穿梭載體pHZ1272進行連接，轉化大腸桿菌DH5a，挑取轉化子提取質粒進行酶切鑒定。5.如權利要求4所述的構建方法，其特征在于，所述內源性溶菌酶基因為帶有強啟動子的內源性溶菌酶基因SCN_RS20110。6.如權利要求4所述的構建方法...

【專利技術屬性】
技術研發人員：鐘傳青，曹廣祥，付加芳，宗工理，
申請(專利權)人：山東建筑大學，山東省醫藥生物技術研究中心，
類型：發明
國別省市：山東;37