一種去除血紅素的大腸桿菌鐵蛋白突變體及包含它的重組體系制造技術

本發明專利技術公開了一種去除血紅素的大腸桿菌鐵蛋白突變體及包含它的重組體系。去除血紅素的大腸桿菌鐵蛋白突變體，其DNA序列如SEQ?NO：1所示。與現有技術相比，本發明專利技術所提供的去除血紅素的大腸桿菌鐵蛋白突變體(M52A突變體)具有降低蛋白穩定性和可化學誘導重新獲得蛋白穩定性的特性，其四級結構并未發生明顯變化，仍為球形殼狀結構；野生型鐵蛋白Tm(50％蛋白質發生變性的溫度)為69.9℃，而突變體M52A的Tm僅為54.3℃，與氯化血紅素化學誘導后其Tm恢復為67.7℃，因此，該突變體因其具有可調控的溫度穩定性，可作為一種通過小分子誘導控制溫度穩定性的蛋白質納米載體。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種去除血紅素的大腸桿菌鐵蛋白突變體及包含它的重組體系，屬于基因工程

技術介紹
鐵元素是大多數生物有機體進行新陳代謝所必須的元素之一，它在維持細胞生長代謝過程中起到重要的作用。鐵蛋白是一類廣泛存在于動植物、微生物細胞內的用來維持鐵代謝平衡的重要蛋白。大腸桿菌鐵蛋白結構呈球形，由鐵核和蛋白殼兩部分組成，前者以氫氧化鐵和磷酸鹽的形式存在于蛋白殼，后者是由24個亞基單體組成的八面體高度對稱性結構。鐵蛋白外徑12nm，內徑約8nm，由于其獨特的納米級立體空間結構，其在藥物載體以及納米結構材料設計等方面已成為研究熱點。大腸桿菌鐵蛋白的血紅素分子存在于二相對稱軸的相鄰亞基之間，距離蛋白殼外表面10埃，血紅素的卟啉環與二相對稱軸平行，對稱的兩個亞基上的Met52從卟啉環兩側與卟啉環的鐵配位絡合。血紅素參與了蛋白的鐵存儲和釋放過程中的電子傳遞，是細菌鐵蛋白的電子隧道組成之一。Met52被認為是大腸桿菌鐵蛋白與血紅素結合的關鍵氨基酸位點，但將其突變為丙氨酸且發現其對鐵蛋白穩定性影響至今未見報道。
技術實現思路
本專利技術提供一種去除血紅素的大腸桿菌鐵蛋白突變體及包含它的重組體系，所得突變體具有可調控的溫度穩定性，可作為一種通過小分子誘導控制溫度穩定性的蛋白質納米載體。為解決上述技術問題，本專利技術所采用的技術方案如下：一種去除血紅素的大腸桿菌鐵蛋白突變體，其DNA序列如SEQNO：1所示。上述的去除血紅素的大腸桿菌鐵蛋白突變體，為定點突變，是將第52位蛋氨酸突變為丙氨酸。上述去除血紅素的大腸桿菌鐵蛋白突變體，其氨基酸序列如SEQNO：2所示。用于擴增去除血紅素的大腸桿菌鐵蛋白突變體的引物對為：上游引物：5’-ATCGATGAAGCGAAACATGCAGATCG-3’下游引物：5’-GCTTTCATGGTATTCCACATCGTTCAG-3’。上述去除血紅素的大腸桿菌鐵蛋白突變體的純化方法包括順序相接的如下步驟：(1)挑取含重組質粒pET32Ek/LIC-M52A的大腸桿菌搖菌培養；當培養至OD600達到0.6，30℃下用終濃度0.5mMIPTG誘導3h；(2)離心收集菌體并洗滌；(3)用Ni-NTA親和柱純化：向洗滌后的菌體中加入1×BindingBuffer重懸菌體，超聲破碎菌液后離心，然后取離心液通過0.22μm水系膜過濾后上樣，用10mM咪唑洗脫去除雜蛋白，最后用15mM咪唑洗脫液收集目標蛋白洗脫，最后在25℃溫度下用2U/μL腸激酶酶切20h，即可獲得目標蛋白。上述pET32Ek/LIC為載體，M52A為去除血紅素的大腸桿菌鐵蛋白突變體。上述去除血紅素的大腸桿菌鐵蛋白突變體恢復穩定性的化學誘導方法為：將血紅素與去除血紅素的大腸桿菌鐵蛋白突變體以摩爾比1:10均勻混合，在25℃下誘導36h。大腸桿菌細菌鐵蛋白由24個亞基單體組成，該鐵蛋白熱力學穩定性高(熔點Tm為69.9℃)，亞基之間以C4、C3和C2形式高度對稱、精密排列，其中處在C2對稱性上每兩個亞基即存在一個血紅素分子，血紅素是一種鐵卟啉化合物，申請人經研究發現，去除血紅素雖然對鐵蛋白的自組裝沒有明顯影響，但是對其熱穩定性產生較大影響，其Tm值54.3℃遠小于野生型鐵蛋白Tm值69.9℃，且經過氯化血紅素與該突變體M52A化學誘導結合后，發現其Tm值重新恢復至67.7℃，由此可知，突變體M52A對大腸桿菌鐵蛋白穩定性影響很大，且血紅素具有調控鐵蛋白穩定性的作用。一種重組體系，在所述的重組體系上克隆有如SEQNO：1所示的DNA序列；所述的重組體系包括重組質粒和重組菌。本專利技術未提及的技術均參照現有技術。有益效果：與現有技術相比，本專利技術所提供的去除血紅素的大腸桿菌鐵蛋白突變體(M52A突變體)具有降低蛋白穩定性和可化學誘導重新獲得蛋白穩定性的特性，其四級結構并未發生明顯變化，仍為球形殼狀結構；野生型鐵蛋白Tm(50％蛋白質發生變性的溫度)為69.9℃，而突變體M52A的Tm僅為54.3℃，與氯化血紅素化學誘導后其Tm恢復為67.7℃，因此該突變體具有溫度穩定性可調控性；由于鐵蛋白已被廣泛應用于納米材料的載體，此突變體M52A不影響蛋白的聚合度，且仍形成24聚體殼狀結構，因此仍可作為載體應用于納米材料的合成；其顯著優點在于可通過加入小分子化合物氯化血紅素使鐵蛋白溫度穩定性提高，可應用于溫敏性材料的合成。附圖說明圖1是pET32Ek/LIC-M52A的瓊脂糖凝膠核酸電泳圖；圖2是M52A的SDS-PAGE蛋白電泳圖；圖3是M52A和M52A+Hemin在25℃下圓二色譜掃描圖；圖4是M52A和M52A+Hemin在200-600nm范圍內的紫外可見掃描圖；圖5是野生型鐵蛋白、突變體M52A以及M52A+Hemin的熱穩定性比較圖。具體實施方式為了更好地理解本專利技術，下面結合實施例進一步闡明本專利技術的內容，但本專利技術的內容不僅僅局限于下面的實施例。實施例1大腸桿菌鐵蛋白突變基因M52A的制備方法：以含有野生型大腸桿菌鐵蛋白基因的質粒pET32Ek/LIC為模板，通過常規PCR的方法可得到含有點突變M52A的基因序列(引物采用實施例2的引物)。大腸桿菌鐵蛋白突變體M52A基因序列如SEQNO：1所示。實施例2大腸桿菌鐵蛋白基因M52A的克隆：用下述一對引物PCR擴增實施例1中的大腸桿菌鐵蛋白基因：上游引物：5’-ATCGATGAAGCGAAACATGCAGATCG-3’下游引物：5’-GCTTTCATGGTATTCCACATCGTTCAG-3’PCR反應體系：1μL合成序列(實施例1所得)，1μL上游引物，1μL下游引物，10μL5×PrimeSTARTMBuffer，32.5μLddH2O，4μLdNTP，0.5μLPrimeSTARTMHSDNA聚合酶。PCR反應條件：95℃5min；95℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸4.5min，30個循環；72℃延伸10min；4℃保溫。實施例3重組克隆、表達載體pET32Ek/LIC-M52A(實施例2所得)的驗證：將PCR產物(實施例2制備)進行瓊脂糖凝膠驗證：制備10％瓊脂糖凝膠，加入核酸染料至終濃度為0.5μg/mL，將5μLDNA樣品與1μL6×LoadingBuffer混勻，小心加入加樣孔中，同時加入DL10000或1kbladderMarker。設定100～120V恒壓電泳，待溴本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種去除血紅素的大腸桿菌鐵蛋白突變體，其特征在于：其DNA序列如SEQ?NO：1所示。

【技術特征摘要】
1.一種去除血紅素的大腸桿菌鐵蛋白突變體，其特征在于：其DNA序列如SEQNO：
1所示。
2.如權利要求1所述的去除血紅素的大腸桿菌鐵蛋白突變體，其特征在于：為將第
52位蛋氨酸突變為丙氨酸。
3.如權利要求2所述的去除血紅素的大腸桿菌鐵蛋白突變體，其特征在于：其氨基
酸序列如SEQNO：2所示。
4.如權利要求1-3任一項所述的去除血紅素的大腸桿菌鐵蛋白突變體，其特征在于：
其擴增的引物對為：
上游引物：5’-ATCGATGAAGCGAAACATGCAGATCG-3’
下游引物：5’-GCTTTCATGGTATTCCACATCGTTCAG-3’。
5.如權利要求1-3任一項所述的去除血紅素的大腸桿菌鐵蛋白突變體，其特征在于：
其純化方法包括順序相接的如下步驟：
(1)挑取含重組質粒pET32Ek/LIC-M52A的大腸桿菌搖菌培養...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張瑜，周亦琛，王飛，李迅，徐徐，
申請(專利權)人：南京林業大學，
類型：發明
國別省市：江蘇;32