一種利用自殺基因快速篩選細(xì)菌群體感應(yīng)抑制劑的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供一種利用自殺基因快速篩選細(xì)菌群體感應(yīng)抑制劑的方法，在自然光下，沒有被噬菌體侵染的細(xì)菌不顯藍(lán)色，噬菌體侵染的細(xì)菌顯藍(lán)色；在加入致死條件誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)下，具有抑制QS功能的特異多肽因抑制QS分子的活性而不啟動(dòng)自殺基因的表達(dá)，因此存活；而非特異多肽無法抑制QS分子，導(dǎo)致自殺基因啟動(dòng)致死；然后將存活的候選克隆挑出來，進(jìn)一步功能驗(yàn)證，最后通過DNA測(cè)序的方法獲得特異多肽序列對(duì)應(yīng)的DNA序列，從而獲得高效、特異的QSI多肽。本發(fā)明專利技術(shù)步驟簡單，只需要3天至一周左右的時(shí)間，就可以獲得多個(gè)QSI候選多肽，因此具有非常明顯的優(yōu)勢(shì)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及基因工程與適體技術(shù)，公開了針對(duì)篩選細(xì)菌群體感應(yīng)抑制物的噬菌體展示技術(shù)。具體而言，特指一種篩選細(xì)菌群體感應(yīng)抑制物的技術(shù)，該方法同樣也適用于長、短鏈N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯類(AHLs)的群體感應(yīng)分子抑制物的篩選。本專利技術(shù)中涉及的噬菌體展示技術(shù)可適用于例如噬菌體抗體庫、環(huán)肽、線性多肽等帶有隨機(jī)文庫的任何噬菌體文庫。涉及的宿主菌為可以被噬菌體文庫侵染的雄性F’細(xì)菌，例如ER2738、DH5αF’、XL1-Blue，涉及的載體為加入QS分子可導(dǎo)致自身基因誘導(dǎo)細(xì)菌死亡的載體pSB537。屬于病原微生物預(yù)防與控制領(lǐng)域。
技術(shù)介紹
細(xì)菌耐藥的形勢(shì)嚴(yán)峻，如何提高新藥研發(fā)速度，抑制或殺死病原菌的要求迫在眉睫。目前新藥的開發(fā)主要有幾種方法：一是傳統(tǒng)的經(jīng)典方法，即從自然環(huán)境例如土壤或者植物中篩選天然抗生素或者抗菌物質(zhì)。但篩選天然抗菌物質(zhì)的方法存在著過程繁瑣，工作量大等問題，需要在篩選規(guī)模與通量上得到質(zhì)的提高；二是人工合成或者半合成的抗生素，通過修改一些化學(xué)修飾改變化合物結(jié)構(gòu)，提高藥效。但由于同類合成的抗生素都具有類似化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理，因此容易對(duì)同類耐藥細(xì)菌產(chǎn)生抗性；三、近十幾年來在國際知名藥物公司和科研機(jī)構(gòu)中發(fā)展十分迅速的高通量藥物篩選技術(shù)，使新藥的大規(guī)模篩選、靶點(diǎn)確認(rèn)、自動(dòng)化以及效價(jià)評(píng)估成為可能。同時(shí)，該技術(shù)也面臨著篩選模型與數(shù)據(jù)庫有限的技術(shù)難題；除上述幾種抑菌方法以外，還有一些利用細(xì)菌特殊生理功能以及重要靶點(diǎn)的新型抑菌藥物正在研究開發(fā)。例如消除細(xì)菌生物膜生成、抑制細(xì)菌群體感應(yīng)以及抗體靶向抑制耐藥菌的策略。這些方法為新型藥物開發(fā)提供了新的思路，有待于進(jìn)一步研究。細(xì)菌的群體感應(yīng)（QS,quorumsensing）是指細(xì)菌根據(jù)自身細(xì)胞密度變化進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控的群體行為，研究發(fā)現(xiàn)，自然界中大部分的細(xì)菌都存在QS現(xiàn)象，它不僅控制細(xì)菌的生物發(fā)光，還與生物被膜和孢子生成、毒素分泌、質(zhì)粒轉(zhuǎn)移以及包括抗生素在內(nèi)的第二代謝產(chǎn)物合成緊密相關(guān)。目前已知的細(xì)菌QS系統(tǒng)，可以根據(jù)分泌的化學(xué)信號(hào)分子性質(zhì)（又稱為自誘導(dǎo)物，AI,autoinducer）分為以下4類：一類信號(hào)分子為AI-1，是N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯類（AHLs）及其衍生物,廣泛分布在革蘭氏陰性細(xì)菌中并具有種屬特異性。該類分子作用機(jī)理的研究相對(duì)比較透徹：AHLs分子由一系列具有相同高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)和不同碳原子數(shù)目和飽和程度的酰胺側(cè)鏈構(gòu)成，N側(cè)鏈中的碳原子數(shù)多為偶數(shù)（只有C7一個(gè)奇數(shù)），從C4至C18不等，而且在3碳位置上可以有不同的取代基團(tuán)。如圖1所示，以費(fèi)氏弧菌為例，AHLs合成酶LuxI合成特定AHLs并擴(kuò)散到細(xì)胞外，當(dāng)細(xì)胞密度增加到一定閾值時(shí)，AHLs與LuxR家族蛋白結(jié)合，從而使LuxR族蛋白與DNA上的調(diào)控元件結(jié)合，起始轉(zhuǎn)錄LuxCDABEG，啟動(dòng)生物發(fā)光過程；第二類是由LuxS家族蛋白形成的自誘導(dǎo)物AI-2，其主要成分為呋喃酮酰硼酸酯。文獻(xiàn)報(bào)道AI-2在多種革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌中存在，是不同物種細(xì)菌間相互聯(lián)系的通用信號(hào)。另外兩類是在革蘭氏陽性細(xì)菌中獨(dú)有的寡肽類分子AIP（Autoinducingpeptide）以及目前機(jī)制還尚未完全清楚的腎上腺素/去甲腎上腺素信息系統(tǒng)（AI-3）信號(hào)分子。由于QS在細(xì)菌的生命活動(dòng)中所起的重要作用，抑制細(xì)菌群體感應(yīng)并不影響細(xì)菌的生長，但卻可以減少生物膜的生成、影響細(xì)菌毒素的分泌并且很難產(chǎn)生耐藥性，因此，開發(fā)針對(duì)QS相關(guān)基因或者其分泌的信號(hào)小分子物質(zhì)的抑制物，稱之為群體感應(yīng)抑制劑（QSI，quorumsensinginhibitor）或者群體感應(yīng)淬滅（QQ，quorumquenching），是一個(gè)具有廣闊應(yīng)用潛力的抑菌策略，也是今后新型抗生素替代品的理想化合物來源，成為當(dāng)前藥物開發(fā)研究的熱點(diǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
關(guān)于QSI分子的篩選，目前主要集中在對(duì)AHLs和AI-2的抑制上。QSI的來源可以大致分為4種，一種是從環(huán)境中提取的天然QSI分子。例如從海洋紅藻Deliseapulchra、海洋珊瑚Euniceaknighti、大蒜等天然物質(zhì)中提取的AHLs和呋喃酮類物質(zhì)；一種是根據(jù)信號(hào)分子的結(jié)構(gòu)，人工設(shè)計(jì)和合成其相似結(jié)構(gòu)分子，以達(dá)到與QS分子競(jìng)爭(zhēng)底物但又不激活活性的目的；還有一種是利用表達(dá)QS分子降解酶的方法；此外，還有利用QS篩選特異抗體或者適體的方法。以上四種是當(dāng)前獲得QSI的主要來源，但是都存在一些問題：植物等來源的樣品成份復(fù)雜，QSI前期的提取、鑒定和純化過程繁瑣而且還受到樣品純度與溫度、地域等不確定因素的限制；人工設(shè)計(jì)合成與抗體篩選不僅需要專業(yè)的化學(xué)合成與結(jié)構(gòu)分析背景，還要考慮到樣品制備過程的繁瑣程度，專業(yè)的設(shè)備、中間產(chǎn)物毒性與污染評(píng)估以及樣品純度等一系列問題。這些問題制約著QSI分子篩選的進(jìn)一步發(fā)展，急需一種能快速、高通量地篩選出高效QSI分子的新方法。因此，本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題是：建立一種簡單、快速地篩選抑制不同類型QS分子特異性多肽的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采用如下技術(shù)方案：將噬菌體展示隨機(jī)肽庫與QS自殺感應(yīng)菌株相結(jié)合的方法來篩選QSI分子。噬菌體展示隨機(jī)肽庫（Phagedisplay），是將一段長度大約為15-36bp的隨機(jī)核苷酸序列插入噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因內(nèi)，外源短肽隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面。理論上,7個(gè)隨機(jī)氨基酸序列可產(chǎn)生約207種多肽序列，可以作為“人工抗體”，篩選出能特異性結(jié)合靶物質(zhì)的多肽。該技術(shù)一般采用生物淘選（Biopanning）的方法來篩選抗原表位，其基本技術(shù)流程大致為：將靶蛋白或物質(zhì)包被固定在聚乙烯平板中，再加入噬菌體展示肽庫與之特異性結(jié)合，經(jīng)過多輪的清洗和篩選后，獲得與靶物質(zhì)結(jié)合較緊密的噬菌體克隆，最終確認(rèn)特異的短肽序列。但由于本專利研究的靶物質(zhì)是N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯類（AHLs）以及呋喃酮酰硼酸酯等小分子物質(zhì)，很難直接包被在平板上進(jìn)行富集，因此本專利中采用一個(gè)與傳統(tǒng)生物淘選方法完全不同的特異多肽篩選策略。主要原理是如圖2所示：感應(yīng)到QS分子將致死的感應(yīng)菌株與噬菌體隨機(jī)肽庫孵育侵染，在添加入相應(yīng)抗生素、特異QS信號(hào)分子、致死條件誘導(dǎo)劑和IPTG/X-gal誘導(dǎo)孵育平板長菌。在自然光下，沒有被噬菌體侵染的細(xì)菌不顯藍(lán)色，噬菌體侵染的細(xì)菌顯藍(lán)色；在加入致死條件誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)下，具有抑制QS功能的特異多肽因抑制QS分子的活性而不啟動(dòng)自殺基因的表達(dá)，因此存活。而非特異多肽無法抑制QS分子，導(dǎo)致自殺基因啟動(dòng)致死。然后將存活的候選克隆挑出來，進(jìn)一步功能驗(yàn)證，最后通過DNA測(cè)序的方法獲得特異多肽序列對(duì)應(yīng)的DNA序列，從而獲得高效、特異的QS本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種利用自殺基因快速篩選細(xì)菌群體感應(yīng)抑制劑的方法，其特征在于：所述方法為：感應(yīng)到QS分子將致死的感應(yīng)菌株與噬菌體隨機(jī)肽庫孵育侵染，再添加入相應(yīng)抗生素、特異QS分子、致死條件誘導(dǎo)劑和IPTG/X?gal誘導(dǎo)孵育平板長菌，在自然光下，沒有被噬菌體侵染的細(xì)菌不顯藍(lán)色，噬菌體侵染的細(xì)菌顯藍(lán)色；在加入致死條件誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)下，具有抑制QS功能的特異多肽因抑制QS分子的活性而不啟動(dòng)自殺基因的表達(dá)，因此存活；而非特異多肽無法抑制QS分子，導(dǎo)致自殺基因啟動(dòng)致死；然后將存活的候選克隆挑出來，進(jìn)一步功能驗(yàn)證，最后通過DNA測(cè)序的方法獲得特異多肽序列對(duì)應(yīng)的DNA序列，從而獲得高效、特異的QSI多肽。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種利用自殺基因快速篩選細(xì)菌群體感應(yīng)抑制劑的方法，其特征在于：所述方法為：
感應(yīng)到QS分子將致死的感應(yīng)菌株與噬菌體隨機(jī)肽庫孵育侵染，再添加入相應(yīng)抗生素、特異
QS分子、致死條件誘導(dǎo)劑和IPTG/X-gal誘導(dǎo)孵育平板長菌，在自然光下，沒有被噬菌體侵染
的細(xì)菌不顯藍(lán)色，噬菌體侵染的細(xì)菌顯藍(lán)色；在加入致死條件誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)下，具有抑制QS功
能的特異多肽因抑制QS分子的活性而不啟動(dòng)自殺基因的表達(dá)，因此存活；而非特異多肽無
法抑制QS分子，導(dǎo)致自殺基因啟動(dòng)致死；然后將存活的候選克隆挑出來，進(jìn)一步功能驗(yàn)證，
最后通過DNA測(cè)序的方法獲得特異多肽序列對(duì)應(yīng)的DNA序列，從而獲得高效、特異的QSI多
肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用自殺基因快速篩選細(xì)菌群體感應(yīng)抑制劑的方法，其
特征在于：所述方法具體包括如下：
（1）將QS信號(hào)分子C4-AHL感應(yīng)自殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)入大腸桿菌ER2738菌株，獲得菌株，從劃線
平板中挑取該單菌落并接種到5ml添加有20μg/mL四環(huán)素和100μg/mL氨芐青霉素的LB
培養(yǎng)基中，37oC、250rpm振蕩過夜，以2%接種量轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)基中，然后在200rpm條件
下振蕩至對(duì)數(shù)生長中期并收集1mL菌體后重懸于200μLLB培養(yǎng)基中待用；
（2）將噬菌體肽庫放置冰上化凍，取10μL稀釋到90μL無菌水中，再分別將步驟（1）中
待用重懸后的200μL菌液與10μL已稀釋的噬菌體肽庫輕輕混勻，在室溫條件下孵育2-5
min；吸取上述所有預(yù)混液加入3mL、45oC溫浴已融化的含有10-30wt.%蔗糖、0.7wt.%
瓊脂粉的上層瓊脂LB培養(yǎng)基中，迅速充分混勻并傾倒到添加含有終濃度為20μg/mL四環(huán)
素、100μg/mL氨芐青霉素、10μMC4-AHL、10-30wt.%蔗糖、1.5wt.%瓊脂粉的IPTG/X-
galLB培養(yǎng)基平板上；待上層瓊脂充分凝固后，倒置放入37oC培養(yǎng)箱中靜...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：林向民，姚祖杰，林文雄，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：福建農(nóng)林大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：福建;35