鏈格孢霉毒素細(xì)交鏈格孢菌酮酸人工抗原、多克隆抗體及制備方法和應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種鏈格孢霉毒素細(xì)交鏈格孢菌酮酸人工抗原、多克隆抗體及制備方法和應(yīng)用，具體公開了一種作為細(xì)交鏈格孢菌酮酸半抗原的化合物(式I)，半抗原TAO與牛血清蛋白和血藍(lán)蛋白等大分子蛋白偶聯(lián)獲得的人工抗原，由該人工抗原制備得到的多克隆抗體以及它們?cè)跈z測細(xì)交鏈格孢菌酮酸中的應(yīng)用。本研究通過建立間接競爭ELISA方法可檢測TA，為TA免疫學(xué)檢測方法提供理論依據(jù)并為進(jìn)一步開發(fā)檢測TA的免疫學(xué)速測產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)，為建立TA的免疫學(xué)檢測方法、開發(fā)TA的免疫學(xué)系列產(chǎn)品，快速、高效地監(jiān)控TA的污染情況提供了又一條新途徑。

Artificial antigen, polyclonal antibody, preparation method and application of Alternaria Alternaria Alternaria acid

The invention discloses a toxin of Alternaria Alternaria alternate acid artificial antigen, polyclonal antibody and preparation method and application thereof, in particular discloses a as Alternaria alternate acid hapten compound (I), artificial antigen TAO hapten with bovine serum albumin and blood blue protein macromolecules such as protein coupling the polyclonal antibody by the artificial antigen prepared and their application in the detection of Alternaria tenuis in acid. In this study, through the establishment of indirect competitive ELISA method can detect TA, provide a theoretical basis for the immunological detection of TA method and lay the foundation for the further development of immunological detection of TA rapid detection products, immunology products for immunological detection methods, establish the development of TA TA, provides a new way of fast and high efficiency of pollution monitoring TA.

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于分析檢測
，具體涉及一種鏈格孢霉毒素細(xì)交鏈格孢菌酮酸人工抗原、多克隆抗體及制備方法和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
細(xì)交鏈格孢菌酮酸(Tenuazonicacid，TA)是鏈格孢霉、稻瘟病霉等霉菌在特定條件下產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物之一，在美國、加拿大、巴西、中國等國家均有發(fā)現(xiàn)。TA可廣泛污染食品及飼料，導(dǎo)致水果、谷物以及蔬菜的采后腐爛，并可寄生、腐生植物體內(nèi)導(dǎo)致莖點(diǎn)霉病以及水稻稻瘟病等。在目前已知的70多種具有明顯毒性的鏈格孢霉毒素中，TA毒性最強(qiáng)且污染水平居各種鏈格孢霉毒素之首。TA具有多種生物特性，如通過抑制核糖體的釋放抑制蛋白質(zhì)的合成，抗病毒、抗腫瘤、抑菌性、細(xì)胞毒性和植物毒性，并且對(duì)哺乳動(dòng)物(小鼠、大鼠等)也具有急性毒性。但是目前關(guān)于TA對(duì)人類及動(dòng)物相關(guān)危害的數(shù)據(jù)相對(duì)比較缺乏，包括歐美等發(fā)達(dá)國家和地區(qū)也尚未頒布關(guān)于TA毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)。TA的污染水平一般為μg/kg，需要較高水平的檢測靈敏度，利用免疫學(xué)檢測霉菌毒素與儀器方法互補(bǔ)獲得較高的檢測靈敏度是目前霉菌毒素檢測領(lǐng)域研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)方法。TA分子結(jié)構(gòu)式為C9H13O3N，分子量較小(M＝197)，本身無法產(chǎn)生免疫原性，通常要對(duì)TA進(jìn)行半抗原修飾和人工抗原的合成研究，才能制備得到免疫抗體繼而進(jìn)一步開發(fā)免疫產(chǎn)品與方法，而目前市場上尚無商品化的TA免疫產(chǎn)品出現(xiàn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
有鑒于此，本專利技術(shù)的目的之一在于提供一種鏈格孢霉毒素細(xì)交鏈格孢菌酮酸人工抗原，>目的之二在于提供該人工抗原的多克隆抗體，目的之三在于提供該人工抗原的制備方法和應(yīng)用。本專利技術(shù)采取的技術(shù)方案如下：1、作為細(xì)交鏈格孢菌酮酸半抗原的化合物，具有式I所述結(jié)構(gòu)：命名為TAO。2、TAO化合物的制備方法，包括如下步驟：按質(zhì)量體積比13:17(mg:mL)的比例將細(xì)交鏈格孢菌酮酸溶于混合溶劑A中，加入過量羧甲基羥胺半鹽酸鹽，混合均勻后回流加熱15h，冷卻，減壓干燥，加入2M的鹽酸溶解，二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮得膠狀物，將膠狀物用二氯甲烷/正己烷重沉淀純化即得；所述混合溶劑A為甲醇、吡啶和水按體積比為1:4:1的比例混合而得。3、細(xì)交鏈格孢菌酮酸人工抗原，將半抗原TAO與牛血清蛋白偶聯(lián)獲得人工抗原TAO-BSA，或與血藍(lán)蛋白偶聯(lián)獲得人工抗原TAO-KLH。需要說明的是，半抗原TAO還可以與其它蛋白偶聯(lián)獲得人工抗原，而不僅限于BSA和KLH蛋白，并且其它蛋白偶聯(lián)獲得的人工抗原仍舊在本專利技術(shù)的保護(hù)范圍內(nèi)。4、細(xì)交鏈格孢菌酮酸人工抗原的制備方法，包括如下步驟：按摩爾比為1：1.5～5：5～10的比例稱取TAO、N-羥基琥珀酰亞胺和二環(huán)己基碳二亞胺，分別溶解于二甲基甲酰胺后再緩慢滴加混合，室溫下避光攪拌16h，4℃冷卻2h以上，10000r/min離心5min，得到上清液，將上清液與牛血清蛋白按摩爾比60～80：1，或與血藍(lán)蛋白按摩爾比250～350：1的比例進(jìn)行偶聯(lián)，4℃攪拌反應(yīng)2h后PBS4℃透析純化。5、細(xì)交鏈格孢菌酮酸抗體，由細(xì)交鏈格孢菌酮酸半抗原化合物或由細(xì)交鏈格孢菌酮酸人工抗原制備得到。優(yōu)選的，所述抗體為多克隆抗體、單克隆抗體或基因工程抗體。6、細(xì)交鏈格孢菌酮酸半抗原化合物、細(xì)交鏈格孢菌酮酸人工抗原、細(xì)交鏈格孢菌酮酸抗體在檢測細(xì)交鏈格孢菌酮酸中的應(yīng)用。本專利技術(shù)的有益效果在于：本研究采用肟化法用羧甲基羥胺半鹽酸鹽對(duì)鏈格孢霉毒素細(xì)交鏈格孢菌酮酸(Tenuaconicacid,TA)進(jìn)行衍生后引入連接臂，得到了半抗原TAO。通過活性酯法將半抗原TAO分別與牛血清蛋白(Bovineserumalbumin，BSA)偶聯(lián)制備得到免疫原TAO-BSA、與血藍(lán)蛋白(KeyholeLimpetHemocyanin，KLH)偶聯(lián)制備得到包被原TAO-KLH。經(jīng)透析純化后分別采用紫外光譜、紅外光譜掃描法對(duì)合成的人工抗原進(jìn)行初步鑒定，制備得到的人工抗原的偶聯(lián)比分別為18.3:1、38.7:1。此人工抗原免疫Balb/c小鼠后獲得的鼠源抗血清進(jìn)一步驗(yàn)證了人工抗原合成成功，制備得到特異性識(shí)別TA的多克隆抗體。通過ELISA棋盤法確定了最佳包被原濃度以及最佳抗體稀釋度并建立了TA間接競爭ELISA檢測方法，其靈敏度以半抑制濃度IC50表示為4.0ng/mL，最低檢出限(LOD)為0.1198ng/mL，0.2-65ng/mL。本研究通過建立可檢測TA的間接競爭ELISA方法，為TA免疫學(xué)檢測方法提供理論依據(jù)并為進(jìn)一步開發(fā)檢測TA的免疫學(xué)速測產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)，為建立TA的免疫學(xué)檢測方法、開發(fā)TA的免疫學(xué)系列產(chǎn)品，快速、高效地監(jiān)控TA的污染情況提供了又一條新途徑。附圖說明為了使本專利技術(shù)的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本專利技術(shù)提供如下附圖：圖1半抗原TAO質(zhì)譜圖；圖2TAO-BSA紫外吸收譜圖；圖3TAO-KLH紫外吸收譜圖；圖4TA、BSA、KLH、TAO-BSA、TAO-KLH紅外光譜圖；圖5抗體競爭抑制率曲線。具體實(shí)施方式下面對(duì)本專利技術(shù)的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。試劑：TA銅鹽(純度＞99％，成都杰銳科技有限公司)；牛血清蛋白(Bovineserumalbumin，BSA)、血藍(lán)蛋白(KeyholeLimpetHemocyanin，KLH)(sigma公司)；弗氏完全佐劑與不完全佐劑(Sigma公司)；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)；N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，羧甲基羥胺半鹽酸鹽((H2NOCH2CO2H)2-HCl)(成都科龍化工試劑公司)；酶標(biāo)羊抗鼠IgG抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。實(shí)施例1半抗原TAO的合成取1.3mg(6.6×10-3mmol)TA溶于混合溶劑(甲醇：吡啶：水＝1:4:1)1.70mL中，加入羧甲基羥胺半鹽酸鹽(H2NOCH2CO2H)2-HCl3.3mg，混合均勻后，加入至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中回流加熱15h，冷卻至室溫后過夜。將混合物減壓干燥，加入0.30mL2M的HCl，盡量用二氯甲烷萃取水相中的合成物，合并有機(jī)相，通過加入無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮得膠狀物。通過二氯甲烷/正己烷重沉淀純化，得到淺棕色粉末，-20℃儲(chǔ)存，HPLC/MS檢測。利用TA在C4位上的羥基，與羧甲基羥胺半鹽酸鹽反應(yīng)后得到半抗原，并用質(zhì)譜定性檢測半抗原結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖1所示。TA的分子量為197，圖1中在m/z195.2處出現(xiàn)峰值，說明樣品中含有未反應(yīng)本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
作為細(xì)交鏈格孢菌酮酸半抗原的化合物，其特征在于，具有式I所述結(jié)構(gòu)：命名為TAO。

【技術(shù)特征摘要】
1.作為細(xì)交鏈格孢菌酮酸半抗原的化合物，其特征在于，具有式I所述結(jié)構(gòu)：
命名為TAO。
2.權(quán)利要求1所述化合物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
按質(zhì)量體積比13:17(mg:mL)的比例將細(xì)交鏈格孢菌酮酸溶于混合溶劑A中，加入過量羧
甲基羥胺半鹽酸鹽，混合均勻后回流加熱15h，冷卻，減壓干燥，加入2M的鹽酸溶解，二氯
甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮得膠狀物，將膠狀物用二氯甲烷/正己烷重沉淀純化即
得；所述混合溶劑A為甲醇、吡啶和水按體積比為1:4:1的比例混合而得。
3.細(xì)交鏈格孢菌酮酸人工抗原，其特征在于，將半抗原TAO與牛血清蛋白偶聯(lián)獲得人
工抗原TAO-BSA，或與血藍(lán)蛋白偶聯(lián)獲得人工抗原TAO-KLH。
4.權(quán)利要求3所述細(xì)交鏈格孢菌酮酸人工抗原的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
按摩爾比為1：1.5～5：5～10的比...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：馬良，張宇昊，吳春生，鐘紅，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：西南大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：重慶;50