檢測EGFR基因L858R位點的特異性引物、探針及試劑盒制造技術

本發明專利技術涉及分子檢測，具體公開了用于檢測EGFR基因L858R突變位點的特異性引物、探針及試劑盒。所述特異性引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO?1～2所示，所述探針的核苷酸序列如SEQ?ID?NO?3～4所示。利用本發明專利技術提供的特異性引物和MGB-Taqman探針應用探針方法檢測EGFR基因L858R，不僅適用于對腫瘤組織，石蠟包埋組織來源的核酸進行檢測，更加適用于對血液循環游離核酸中EGFR基因L858R突變的位點的檢測；且結合該檢測體系和微滴式數字PCR系統可對核酸樣本的突變頻率進行準確檢出。

Specific primer, probe and kit for detecting EGFR gene L858R locus

The invention relates to molecular detection, in particular to a specific primer, probe and kit for detecting L858R mutation site of EGFR gene. The specific primers of the nucleotide sequence of SEQ ID NO 1 ~ 2, the nucleotide sequence of the probes such as SEQ ID NO 3 ~ 4 shows. Detection of L858R EGFR gene the specific primers and MGB-Taqman probes using probe method, not only applies to the tumor tissue, paraffin embedded tissue derived nucleic acid detection, which is more suitable for the detection of circulating EGFR free nucleic acids in a mutation of the L858R gene on blood; and combined with the testing system and micro droplet the digital PCR system of nucleic acid mutation frequency for accurate detection.

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及分子檢測，具體地說，涉及檢測EGFR基因L858R突變位點的特異性引物、探針及試劑盒。
技術介紹
表皮生長因子受體(EpidermalGrowthFactorReceptor,EGFR)是上皮生長因子(EGF)細胞增殖和信號傳導的受體。EGFR屬于HER或ErbB受體家族的一員，該家族包括EGFR(ErbB-1)、HER2/c-neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)和Her4(ErbB-4)。EGFR也常被稱作HER1或ErbB1。EGFR及其家族成員能夠調控細胞分化、凋亡、細胞運動、新血管生成、浸潤和轉移等多項生理過程，同時在大部分的人類腫瘤中都有表達，因此EGFR已經被證明在眾多腫瘤的發生、發展及預后過程中發揮了重要調控作用。EGFR是典型的具有酪氨酸激酶(TyrosineKinase,TK)活性的受體，TK在EGFR的活性中發揮了關鍵作用。美國FDA批準對擬采用易瑞沙、特羅凱等EGFR-TKI治療的患者，進行EGFR基因突變檢測。需要指出，檢測EGFR基因突變并不能作為患者是否患癌的依據。在我國《NCCN:非小細胞肺癌臨床實踐指南(中國版)》中只是明確提出了臨床實踐中EGFR-TKI治療前需要針對EGFR編碼區第18、19、20和21外顯子的突變位點開展檢測。CN103740843A公開了一種檢測人表皮生長因子受體基因EGFR外顯子21上L858R點突變的方法及試劑盒；以數字PCR為平臺，在反應體系中加入PCR引物和TaqMan探針，利用兩條標記不同類型熒光的TaqMan探針對野生和突變DNA模板進行檢測；根據熒光類型判斷樣品中DNA模板的類型及其數量及比例。但該技術方案的引物探針組合的突變檢出率僅能達到2500分之一。CN103333963A公開了一組用來檢測EGFR基因L858R點突變的引物組及用此引物組來檢測EGFR基因L858R點突變的方法。然而，其只有引物序列，檢測效率不如探針法，不能檢出突變頻率。CN102851375A公開了一種檢測EGFR基因突變的引物、探針及其試劑盒和使用方法。其能夠檢出含0.1～1％EGFR基因突變DNA的樣本，但血液循環游離核酸的突變有時低于該頻率，因此該技術方案不適用于血液循環游離核酸的檢測。
技術實現思路
為了解決現有技術中存在的問題，本專利技術的目的是提供一種用于檢測血液循環游離核酸中EGFR基因L858R位點的特異性引物、探針及試劑盒。為了實現本專利技術目的，本專利技術的技術方案如下：第一方面，本專利技術提供一種用于檢測EGFR基因L858R位點的特異性引物，其核苷酸序列為：前向引物：ACACCGCAGCATGTCAAGATC；反向引物：CAGCCTGGTCCCTGGTGTCAG。第二方面，本專利技術提供與所述引物配合使用的探針，其核苷酸序列為：VIC：5’-VIC-GGCCAGCCCAAA-MGB-NFQ-3'；FAM：5'-FAM-GGCCCGCCCAAA-MGB-NFQ-3'。第三方面，本專利技術提供含有所述引物和所述探針的試劑。第四方面，本專利技術提供含有所述引物和所述探針的試劑盒。第五方面，本專利技術提供一種檢測血液循環游離核酸中EGFR基因L858R位點的方法，以血液游離核酸為模板，利用所述引物和所述探針進行數字PCR驗證，數字PCR依據檢測熒光信號給出拷貝數判定結果。數字PCR檢測方法具體為：標準PCR反應體系經過微滴發生后，分配到約20000個微滴中，每個微滴包含或不包含一個或多個拷貝的目標分子(DNA模板)，實現“單分子模板PCR擴增”，擴增結束后，含有核酸分子模板的微滴會給出熒光信號，沒有模板的微滴就沒有熒光信號產生。最終根據泊松分布原理以及陽性微滴的比例，分析軟件可計算給出待檢靶分子的濃度或拷貝數。數字PCR可以直接計算目標序列的拷貝數，因此無需依賴于對照樣品和標準曲線就可以進行精確的絕對定量檢測；此外，由于數字PCR在進行結果判讀時僅判斷有/無兩種擴增狀態，因此也不需要檢測熒光信號與設定閾值線的交點，完全不依賴于Ct值的鑒定，因此數字PCR的反應受擴增效率的影響大大降低，對PCR反應抑制物的耐受能力大大提高；數字PCR實驗中標準反應體系分配的過程可以極大程度上降低與目標序列有競爭性作用的背景序列濃度。計算給出待檢靶分子的濃度或拷貝數。數字PCR驗證實驗流程為：配制PCR反應液，配置后室溫靜置3分鐘。將靜置后的PCR反應液轉移到DG8微滴發生卡中的樣品槽，再加入微滴發生專用油。放入QX200DropletGenerator中進行微滴發生反應。轉移生成好的微滴到96孔板。覆上PCR粘性封箔片使用熱封儀進行封片。隨后轉移至PCR以進行擴增反應，反應條件為95℃10分鐘；94℃30秒，60℃1分鐘，40個循環；98℃10分鐘；4℃持續。反應完成后放入QX200DropletReader進行信號讀取；對數據進行分析。本專利技術還提供了適用于微滴式數字PCR系統的該突變位點的檢測體系。具體包括：2×ddPCR預混液10ul，10uM前向引物1ul，10uM反向引物1ul，2uM的野生型探針2ul，2uM的突變型探針2ul，水3ul，模板1ul，共20ul。本專利技術的有益效果在于：本專利技術提供了用于檢測血液循環游離核酸中EGFR基因L858R位點的方法和檢測試劑盒，適用于對非小細胞肺癌病人靶向用藥厄洛替尼片，吉非替尼等的評估。本專利技術提供的用于檢測EGFR基因L858R的方法為MGB-Taqman探針方法，不僅適用于對腫瘤組織，石蠟包埋組織來源的核酸進行檢測，更加適用于對血液循環游離核酸中EGFR基因L858R突變的位點的檢測；且結合該檢測體系和微滴式數字PCR系統可對核酸樣本的突變頻率進行準確檢出。檢測該突變位點的引物和探針序列如下文所示，本專利技術還提供了對EGFR基因L858R突變位點進行拷貝數檢測的試劑盒。本專利技術提供的EGFR基因L858R突變位點檢測方法肺癌靶向用藥，病情監測和預后評估方面，為臨床提供了有效的指導。本專利技術提供的特異性引物和探針，能夠對血液游離核酸進行準確檢測，在檢測突變同時可以直接給出基因位點的突變頻率，且結合數字PCR系統對突變的檢出可達5000分之一，靈敏度高。附圖說明圖1為本專利技術實施例3中以包含EGFR基因L858R突變位點的突變質粒(mutant)和包含該位點野生型的質粒本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于檢測EGFR基因L858R位點的特異性引物，其特征在于，其核苷酸序列為：前向引物：ACACCGCAGCATGTCAAGATC；反向引物：CAGCCTGGTCCCTGGTGTCAG。

【技術特征摘要】
1.一種用于檢測EGFR基因L858R位點的特異性引物，其特征在
于，其核苷酸序列為：
前向引物：ACACCGCAGCATGTCAAGATC；
反向引物：CAGCCTGGTCCCTGGTGTCAG。
2.與權利要求1所述引物配合使用的探針，其特征在于，其核苷
酸序列為：
VIC：5’-VIC-GGCCAGCCCAAA-MGB-NFQ-3'；
FAM：5'-FAM-GGCC...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李俊博，武會娟，安云鶴，田彥捷，王金龍，
申請(專利權)人：北京市理化分析測試中心，
類型：發明
國別省市：北京;11