一株重組細胞及其在制備抗人表皮生長因子受體治療藥物中的應用制造技術

本發明專利技術公開了一株重組細胞及其在制備抗人表皮生長因子受體治療藥物中的應用。本發明專利技術提供的重組細胞CHO-K1-EGFR-7gRNA是將CHO-K1-EGFR細胞的基因組中序列表的序列6所示的DNA分子取代為序列表的序列7所示的DNA分子得到的重組細胞；CHO-K1-EGFR細胞的制備方法如下：將產品甲和產品乙共同導入CHO-K1細胞；產品甲為如下(a)或(b)：DNA分子甲；(b)含有DNA分子甲的重組表達載體甲；DNA分子甲為編碼序列表的序列1所示的輕鏈L4的DNA分子；產品乙為如下(c)或(d)：DNA分子乙；(b)含有DNA分子乙的重組表達載體乙；DNA分子乙為編碼序列表的序列3所示的重鏈H3的DNA分子。本發明專利技術對于癌癥的治療具有重大的應用價值。

Recombinant cell and application thereof in preparing medicament for treating human epidermal growth factor receptor

The present invention discloses one kind of recombinant cell and its application in preparing medicine for treating human epidermal growth factor receptor. Recombinant CHO-K1-EGFR-7gRNA cells provided by the invention is DNA sequence sequence list of the genome of CHO-K1-EGFR cells in 6 shown recombinant cells were obtained for DNA substituted molecular sequences shown in Table 7; preparation method is as follows: CHO-K1-EGFR cells a and B are common products into CHO-K1 cells; a product as follows (a) or (b) a:DNA molecule; (b) DNA containing a recombinant molecule expression vector; DNA molecule DNA as a light chain L4 sequence encoding sequence table 1 shows the products as follows; B (c) or (d):DNA (b) containing DNA B; molecular B recombinant expression vector B; DNA molecular H3 heavy chain sequence encoding DNA molecule B sequence table 3 shows the. The invention has great application value for the treatment of cancer.

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一株重組細胞及其在制備抗人表皮生長因子受體治療藥物中的應用。
技術介紹
近年來，治療性抗體在臨床上的應用越來越廣泛。2000-2010年，抗體藥物在全球生物制藥中所占份額從10.5％擴張到56.41％，預計2015年全球抗體藥物市場規模有望達到680億美元。抗體恒定區缺少核心巖藻糖基化的治療性抗體目前正處于臨床研究中，它們在體外和體內都可以促進抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(antibodydependentcellularcytotoxicity,ADCC),這種生理活性引起人們廣泛關注，并成為此類藥物研究的熱點之一。近年出現多種基因組編輯技術，主要有：鋅脂核酸酶技術(zincfingernuclease,ZFNs)、轉錄激活樣效應核酸酶技術(transcriptionactivator-likeeffectornucleases,TALEN)與RNA導向的CRISPR-Cas9核酸酶系統。CRISPR-Cas9核酸酶系統是近年來發現并被廣泛應用于真核細胞基因組編輯的一種技術。該技術利用Cas9切割靶序列形成雙鏈斷裂(DSB)，隨后通過非同源末端連接(NHEJ)或同源定向修復(HDR)進而達到對靶基因序列編輯的目的。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一株重組細胞及其在制備抗人表皮生長因子受體治療藥物中的應用。本專利技術首先保護一株重組細胞，即重組細胞CHO-K1-EGFR-7gRNA。重組細胞r>CHO-K1-EGFR-7gRNA是將CHO-K1-EGFR細胞的基因組中序列表的序列6所示的DNA分子取代為序列表的序列7所示的DNA分子得到的重組細胞；所述CHO-K1-EGFR細胞的制備方法如下：將產品甲和產品乙共同導入CHO-K1細胞，得到CHO-K1-EGFR細胞；所述產品甲為如下(a)或(b)：DNA分子甲；(b)含有所述DNA分子甲的重組表達載體甲；所述DNA分子甲為編碼序列表的序列1所示的輕鏈L4的DNA分子。所述DNA分子甲具體可為序列表的序列2所示的DNA分子或序列表的序列2自5’末端第9-729位核苷酸所示的DNA分子或序列表的序列2自5’末端第85-726位核苷酸所示的DNA分子。所述重組表達載體甲具體可為在pcDNA-3.3載體的多克隆位點(例如HindⅢ和NotI酶切位點之間)插入所述DNA分子甲得到的重組質粒。所述產品乙為如下(c)或(d)：DNA分子乙；(b)含有所述DNA分子乙的重組表達載體乙；所述DNA分子乙為編碼序列表的序列3所示的重鏈H3的DNA分子。所述DNA分子乙具體可為序列表的序列4所示的DNA分子。所述重組表達載體乙具體可為在pOptiVEC載體的多克隆位點(例如HindⅢ和NotI酶切位點之間)插入所述DNA分子乙得到的重組質粒。以上任一所述重組細胞CHO-K1-EGFR-7gRNA分泌的抗體(IgG)也屬于本專利技術的保護范圍。本專利技術還保護所述抗體在制備用于殺傷腫瘤細胞的藥物中的應用。所述腫瘤細胞可為表皮癌細胞。所述腫瘤細胞具體可為A431細胞。本專利技術還保護一種用于殺傷腫瘤細胞的藥物，其活性成分為所述抗體。所述腫瘤細胞可為表皮癌細胞。所述腫瘤細胞具體可為A431細胞。本專利技術還保護所述抗體在制備用于治療癌癥的藥物中的應用。所述癌癥可為表皮癌。所述癌癥具體可為A431細胞引起的表皮癌。本專利技術還保護一種用于治療癌癥的藥物，其活性成分為所述抗體。所述癌癥可為表皮癌。所述癌癥具體可為A431細胞引起的表皮癌。本專利技術對于癌癥的治療具有重大的應用價值。附圖說明圖1為7種gRNA在Fut8中靶標位置。圖2為WesternBlot的結果。圖3為錯配酶T7E1檢測切割效率的結果。圖4為細胞生長情況檢測的結果。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本專利技術，但并不限定本專利技術。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。pSpCas9(BB)-2A-Puro載體：購自addgene，目錄號PX459。CHO-K1細胞：ATCC，CCL-61。CDCHOMedium：Gibco產品，目錄號10743-029。OptiMEMIMedium：Gibco產品，目錄號31985-070。脂質體(FugeneHD)：購于Promega公司，目錄號E2311。嘌呤霉素：購于GeneOperation公司，目錄號ISY1130-0025MG。西妥昔單抗(溶液形式：100mg/50ml，無色透明液體，IgG抗體):德國Merck公司，進口藥品證號：S20050095，產品批號7667201。A431細胞(人表皮癌細胞)：ATCC，CRL-1555。pcDNA-3.3載體：Invitrogen公司，目錄號K8300-01。pOptiVEC載體：Invitrogen公司，目錄號12744-017。輕鏈L4的氨基酸序列如序列表的序列1所示，其編碼基因如序列表的序列2自5’末端第85-726位核苷酸所示。重鏈H3由重鏈可變區(VH)、重鏈恒定區1(CH1)、鉸鏈區、重鏈恒定區2(CH2)和重鏈恒定區3(CH3)組成(H3＝VH+CH1+hinge+CH2+CH3)。重鏈H3的氨基酸序列如序列表的序列3所示，其編碼基因如序列表的序列4所示。序列表的序列3中，第1-145位氨基酸為重鏈可變區(VH)，第146-243位氨基酸為重鏈恒定區1(CH1)，第244-258位氨基酸為鉸鏈區(hinge)，第259-369位氨基酸為重鏈恒定區2(CH2)，第370-475位氨基酸為重鏈恒定區3(CH3)。實施例1、CHO-K1-EGFR細胞的制備CHO-K1-EGFR細胞即表達抗EGFR人源化抗體L4H3的CHO-K1細胞，其構建過程如下：1、將序列表的序列2自5’末端第9-729位核苷酸所示的雙鏈DNA分子插入pcDNA-3.3載體的HindⅢ和NotI酶切位點之間，得到重組質粒pcDNA-3.3-L4。2、將序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子插入pOptiVEC載體的HindⅢ和NotI酶切位點之間，得到重組質粒pOptiVEC-H3。3、將重組質粒pcDNA-3.3-L4和重組質粒pOptiVEC-H3通過共轉染的方式共同導入CHO-K1細胞，得到重組細胞，將其命名為CHO-K1-EGFR細胞。實施例2、重組細胞的發現一、RNA的設計C本文檔來自技高網...

【技術保護點】
重組細胞CHO?K1?EGFR?7gRNA，是將CHO?K1?EGFR細胞的基因組中序列表的序列6所示的DNA分子取代為序列表的序列7所示的DNA分子得到的重組細胞；所述CHO?K1?EGFR細胞的制備方法如下：將產品甲和產品乙共同導入CHO?K1細胞，得到CHO?K1?EGFR細胞；所述產品甲為如下(a)或(b)：DNA分子甲；(b)含有所述DNA分子甲的重組表達載體甲；所述DNA分子甲為編碼序列表的序列1所示的輕鏈L4的DNA分子；所述產品乙為如下(c)或(d)：DNA分子乙；(b)含有所述DNA分子乙的重組表達載體乙；所述DNA分子乙為編碼序列表的序列3所示的重鏈H3的DNA分子。

【技術特征摘要】
1.重組細胞CHO-K1-EGFR-7gRNA，是將CHO-K1-EGFR細胞的基因組中序列表的序
列6所示的DNA分子取代為序列表的序列7所示的DNA分子得到的重組細胞；
所述CHO-K1-EGFR細胞的制備方法如下：將產品甲和產品乙共同導入CHO-K1細胞，
得到CHO-K1-EGFR細胞；所述產品甲為如下(a)或(b)：DNA分子甲；(b)含有所述DNA
分子甲的重組表達載體甲；所述DNA分子甲為編碼序列表的序列1所示的輕鏈L4的DNA
分子；所述產品乙為如下(c)或(d)：DNA分子乙；(b)含有所述DNA分子乙的重組表
達載體乙；所述DNA分子乙為編碼序列表的序列3所示的重鏈H3的DNA分子。
2.如權利要求1所述的重組細胞CHO-K1-EGFR-7gRNA，其特征在于：
所述DNA分子甲為如下(f1)或(f2)或(f3)：
(f1)序列表的序列2自5’末端第85-726位核苷酸所示的DNA分子；
(f2)序列表的序列2自5’末端第9-729位核苷酸所示的DNA分子；
(f3)序列表的序列2所示的DNA分子；

【專利技術屬性】
技術研發人員：戴維·威孚，王淑敏，朱林，靳彥文，曹誠，張部昌，汪蘇曼，于慶卓，
申請(專利權)人：安徽大學，
類型：發明
國別省市：安徽;34