本發(fā)明專利技術提供了在細胞中使用Cas9的多重基因組工程的方法，包括將編碼與靶DNA互補的一種或多種RNA的第一外來核酸引入至細胞中并且該第一外來核酸向?qū)钢涟蠨NA的循環(huán)步驟，其中，該一種或多種RNA和該酶是用于靶DNA的共定位復合物的成員，以及將編碼一種或多種供體核酸序列的第二外來核酸引入至細胞中，并且其中為了細胞中的多重DNA工程將循環(huán)重復期望的次數(shù)。
【技術實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術】相關申請數(shù)據(jù)本申請要求于2013年7月9日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/844,168的優(yōu)先權，并且將其全部內(nèi)容通過引證合并于此用于所有目的。政府利益的聲明本專利技術是根據(jù)能源部的DE-FG02-02ER63445、國家科學基金會的NSF-SynBERC以及國家科學基金會的SA5283-11210的政府支持下完成的。政府對本專利技術具有一定的權利。
技術介紹
細菌和古細菌CRISPR-Cas體系(system)憑借短的向?qū)NA形成Cas蛋白復合物以指導存在于侵入的外來核酸內(nèi)的互補序列的降解。參見Deltcheva，E.etal.CRISPRRNAmaturationbytrans-encodedsmallRNAandhostfactorRNaseIII.Nature471，602-607(2011)；Gasiunas,G，Barrangou,R.，Horvath,P.&Siksnys,V.Cas9-crRNAribonucleoproteincomplexmediatesspecificDNAcleavageforadaptiveimmunityinbacteria.proceedingsoftheNationalAcademyofSciences109,E2579-2586(2012)；Jinek,M.etal.Aprogrammabledual-RNA-guidedDNAendonucleaseinadaptivebacterialimmunity.Science337,816-821(2012)；Sapranauskas,R.etal.TheStreptococcusthermophilusCRISPR/CassystemprovidesimmunityinEscherichiacoli.Nucleicacidsresearch39,9275-9282(2011)；以及Bhaya,D.,Davison,M.&Barrangou,R.CRISPR-Cassystemsinbacteriaandarchaea:versatilesmallRNAsforadaptivedefenseandregulation.Annualreviewofgenetics45,273-297(2011)。最近化膿性鏈球菌(S.pyogenes)II型CRISPR體系的體外重構(reconstitution)證實了融合至正常反式編碼的tracrRNA(“反式激活的CRISPRRNA”)的crRNA(“CRISPRRNA”)足以指導Cas9蛋白序列特異地切割匹配該crRNA的靶DNA序列。表達與靶位點同源的gRNA導致Cas9募集(recruitment)和靶DNA的降解。參見H.Deveauetal.,PhageresponsetoCRISPR-encodedresistanceinStreptococcusthermophilus.JournalofBacteriology190,1390(Feb,2008)。
技術實現(xiàn)思路
本公開內(nèi)容的方面旨在使用一種或多種x向?qū)NA(核糖核酸)多重修飾在細胞中的DNA以指導由細胞表達的具有核酸酶活性的酶，如具有核酸酶活性的DNA結(jié)合蛋白，至該DNA(脫氧核糖核酸)上的靶位置(targetlocation)，其中，該酶剪切DNA并且使外源供體核酸插入至該DNA中，如通過同源重組。本公開內(nèi)容的方面包括在細胞上循環(huán)或者重復DNA修飾步驟以生成在細胞內(nèi)具有多重DNA修飾(modification)的細胞。修飾可以包括外源供體核酸的插入。通過引入編碼多個RNA以及多個外源供體核酸的核酸至表達酶的細胞，如通過共轉(zhuǎn)化(co-transformation)，的單一步驟，可以實現(xiàn)將多重外源核酸插入，其中表達該RNA并且其中在多個RNA中的每一個向?qū)г撁钢罝NA的特定位點，該酶剪切DNA并且將多個外源核酸中的一個插入至在此剪切位點處的DNA。根據(jù)這個方面，在單一循環(huán)中產(chǎn)生了在細胞中的DNA的多種改變(alteration)或修飾。通過引入編碼一種或多種RNA或多個RNA以及一種或多種外源核酸或多個外源核酸的一種或多種核酸至表達酶的細胞的重復步驟或循環(huán)，可以實現(xiàn)將多重外源核酸插入至細胞中，其中表達RNA并且向?qū)г撁钢罝NA的特定位點，該酶剪切該DNA并且將外源核酸插入至在此剪切位點處的DNA，以使產(chǎn)生具有多重改變或具有外源DNA插入至在細胞內(nèi)的DNA的細胞。根據(jù)一個方面，表達酶的細胞可以是表達天然的酶的細胞或者已經(jīng)遺傳地改變以表達酶(如通過引入編碼該酶的核酸至細胞并且由該細胞可以將其表達)的細胞。以這樣的方式，本公開內(nèi)容的方面包括循環(huán)以下步驟：將RNA引入至表達酶的細胞，將外源供體核酸引入至細胞，表達該RNA，形成該RNA、該酶和DNA的共定位復合物(co-localizationcomplex)，通過酶酶促地剪切DNA，以及將供體核酸插入至該DNA。循環(huán)或者重復以上步驟導致在多重基因座(loci)處的細胞的多重遺傳(genetic)修飾，即，具有多重遺傳修飾的細胞。根據(jù)某些方面，通過循環(huán)以上描述的方法提供了增加同源重組率的方法。在一種實施方式中，基因組Cas9指導的DNA剪切經(jīng)由戲劇性地提高同源重組率刺激了外源DNA。根據(jù)某些另外的方面，外源供體核酸包含同源序列(homologysequences)或者側(cè)接剪切位點的臂(armsflankingthecutsite)。根據(jù)某些另外的方面，外源供體核酸包括除去剪切序列的序列。根據(jù)某些另外的方面，外源供體核酸包括同源序列或者側(cè)接剪切位點的臂以及除去剪切位點的序列。以這樣的方式，Cas9可以用作為針對不包含外源供體DNA的細胞的陰性選擇(negativeselection)。因此，提供了用于鑒別具有高重組頻率的細胞的陰性選擇的方法。根據(jù)某些方面，在本公開內(nèi)容的范圍內(nèi)的DNA結(jié)合蛋白或者酶包括與向?qū)NA形成復合物并且與gRNA一起向?qū)秃衔镏岭p鏈DNA序列(其中該復合物結(jié)合至DNA序列)的蛋白。根據(jù)一個方面，該酶可以是RNA向?qū)У腄NA結(jié)合蛋白，如結(jié)合至DNA并且由RNA向?qū)У腎I型CRISPR體系的RNA向?qū)У腄NA結(jié)合蛋白。根據(jù)一個方面，RNA向?qū)У腄NA結(jié)合蛋白是Cas9蛋白。本公開內(nèi)容的這個方面可以被稱作為RNA與DNA結(jié)合蛋白的共定位至雙鏈DNA或與雙鏈DNA一起共定位。以這樣的方式，DNA結(jié)合蛋白-向?qū)NA復合物可以用于剪切雙鏈DNA的多重位點以便生成具有多重遺傳修飾，如外源供體DNA的多重插入的細胞。根據(jù)某些方面，提供了一種在表本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
一種在表達酶的細胞中對靶DNA進行多重改變的方法，所述酶同與所述靶DNA互補的RNA形成共定位復合物并以位點特異性方式切割所述靶DNA，所述方法包括：(a)將編碼與所述靶DNA互補的一種或多種RNA的第一外來核酸引入至所述細胞中，并且所述第一外來核酸向?qū)雒钢了霭蠨NA，其中所述一種或多種RNA和所述酶是用于所述靶DNA的共定位復合物的成員，將編碼一種或多種供體核酸序列的第二外來核酸引入至所述細胞中，其中，表達所述一種或多種RNA以及所述一種或多種供體核酸序列，其中，所述一種或多種RNA和所述酶共定位至所述靶DNA，所述酶切割所述靶DNA并且將所述供體核酸插入至所述靶DNA以在所述細胞中產(chǎn)生改變的DNA，以及將步驟(a)重復多次以在所述細胞中對于所述DNA產(chǎn)生多重改變。
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2013.07.09 US 61/844,1681.一種在表達酶的細胞中對靶DNA進行多重改變的方法，所述酶同與所述靶DNA互補的
RNA形成共定位復合物并以位點特異性方式切割所述靶DNA，所述方法包括：
(a)將編碼與所述靶DNA互補的一種或多種RNA的第一外來核酸引入至所述細胞中，并
且所述第一外來核酸向?qū)雒钢了霭蠨NA，其中所述一種或多種RNA和所述酶是用于所
述靶DNA的共定位復合物的成員，
將編碼一種或多種供體核酸序列的第二外來核酸引入至所述細胞中，
其中，表達所述一種或多種RNA以及所述一種或多種供體核酸序列，
其中，所述一種或多種RNA和所述酶共定位至所述靶DNA，所述酶切割所述靶DNA并且將
所述供體核酸插入至所述靶DNA以在所述細胞中產(chǎn)生改變的DNA，以及
將步驟(a)重復多次以在所述細胞中對于所述DNA產(chǎn)生多重改變。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述酶是RNA向?qū)У腄NA結(jié)合蛋白。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：喬治·M·丘奇，詹姆士·迪卡洛，
申請(專利權)人：哈佛大學校長及研究員協(xié)會，
類型：發(fā)明
國別省市：美國;US
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