一種具有強熱穩定性的甜味蛋白monellin突變體及其制備方法技術

本發明專利技術公開了一種具有強熱穩定性的甜味蛋白monellin突變體及其制備方法，對單鏈monellin進行了定點突變研究，得到一種熱穩定性和甜度均提升的突變體E23A，并在畢赤酵母中成功表達，解決了甜味蛋白在生產運輸中易降解的技術難題，降低了monellin蛋白在生產運輸中的成本，同時保持其甜味效果，為甜味蛋白大規模工業化市場化打下基礎。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及蛋白突變
，特別是涉及一種具有強熱穩定性的甜味蛋白monellin突變體及其制備方法。
技術介紹
甜味蛋白monellin是西非植物Dioscoreophyllumcumminsii中提取的一種天然甜味劑，具有強烈的甜味，甜度在相同條件下約為相同質量蔗糖的3000倍，天然的monellin蛋白是由兩條不同的肽鏈通過共價鍵結合在一起，由A鏈和B鏈組合而成，研究發現天然的monellin蛋白在高溫下易失去活性，1989年Kim等人通過基因工程方法將兩條肽鏈結合成一條蛋白鏈，使其熱穩定性得到大大提升，在寬范圍PH下保持穩定，同時其甜度未發生太大變化。由于本身不含糖分，可以作為糖尿病人和心血管病人的最好甜味替代食品，也可以有效的預防兒童齲齒的發生，具有非常大的市場潛力。單鏈monellin蛋白在65℃下處理就會失去活性，使其在生產和運輸過程中受到了限制。單鏈monellin蛋白采用基因工程手段也在其他生物中表達成功，如大腸桿菌表達系統、植物表達系統、枯草芽孢桿菌表達系統、但是由于這些表達系統產量和有毒代謝物質的問題使得monellin蛋白無法大規模發酵生產。采用甲醇誘導畢赤酵母發酵使得monellin蛋白產量得到很大提升，但是由于有毒物質甲醇的加入，發酵產品安全問題成為隱患。
技術實現思路
本專利技術的目的就是針對上述存在的缺陷而提供一種具有強熱穩定性的甜味蛋白monellin突變體及其制備方法。針對現有的技術不足，對單鏈monellin進行了定點突變研究，得到一種熱穩定性和甜度均提升的突變體E23A，并在畢赤酵母中成功表達，解決了甜味蛋白在生產運輸中易降解的技術難題，降低了monellin蛋白在生產運輸中的成本，同時保持其甜味效果，為甜味蛋白大規模工業化市場化打下基礎。采用PGAPZαA質粒可以將目的蛋白直接分泌到胞外，節省了后期純化成本，由于本身為GADPH自誘導型啟動子，發酵過程中不需要添加任何誘導劑，減少了發酵過程中的染菌概率，同時沒有任何有毒代謝物質，保證了該蛋白作為食品添加劑的安全。本專利技術的一種具有強熱穩定性的甜味蛋白monellin突變體及其制備方法技術方案為，一種具有強熱穩定性的甜味蛋白monellin突變體，將野生型單鏈monellin基因第23位氨基酸谷氨酸(Glu)定點突變為丙氨酸(Ala)。與野生型單鏈monellin蛋白相比，甜味未下降，熱穩定性提高20℃。所述的一種具有強熱穩定性的甜味蛋白monellin突變體的制備方法，包括以下步驟：(1)構建野生型單鏈monellin蛋白表達載體；(2)將步驟(1)中進行定點突變得到突變基因，挑取陽性轉化子測序驗證；(3)將步驟(2)中測序正確的質粒轉化入畢赤酵母中，篩選出成功轉化的畢赤酵母；(4)在YPD培養基中誘導表達蛋白，時間為3天；(5)將步驟(4)中表達的蛋白純化。步驟(1)為，構建含有野生型單鏈monellin蛋白基因的表達質粒PGAPZαA。步驟(2)突變位點特異性引物：上游P1：[5’-CCCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGGTGAA-3’]；下游P2：[5’-CATACTGACCTATTTTGTTAGCCTCGTCAACAG-3’],上游P3：[5’-CTGTTGACGAGGCTAACAAAATAGGTCAGTATG-3’]；下游P4：[5’-TTGCGGCCGCTTAGGGAGGAGGCACAGGTCCGTTG-3’]。步驟(2)中，設計好引物后，用Xhol和NotI兩種限制性內切酶處理PGAPZαA-SCM，膠回收目的基因和開環質粒，根據以下體系進行PCR反應：上述PCR反應按照如下程序進行：95℃預變性5min；95℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環；72℃終延伸10min。經瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物后再以P1、P4為引物，該PCR產物為模板進行重疊PCR反應，得到突變目的基因。步驟(2)中，用T4DNA連接酶連接PGAPZαA開環質粒和用Xhol和NotI處理后的突變目的基因PCR產物，37℃反應過夜，將連接后的體系物轉化入大腸桿菌DH5α感受態細胞中，涂布于含25μg/mlZeocin的LLB固體培養基上，過夜培養挑取陽性單菌落并提取質粒，測序驗證突變結果，構建突變質粒PGAPZαA-E23A將正確的突變質粒保存備用。步驟(3)中所述的畢赤酵母為畢赤酵母GS115。本專利技術的一種具有強熱穩定性的甜味蛋白monellin突變體及其制備方法有益效果為：本專利技術對單鏈monellin進行了定點突變研究，得到一種熱穩定性和甜度均提升的突變體E23A，并在畢赤酵母中成功表達，解決了甜味蛋白在生產運輸中易降解的技術難題，降低了monellin蛋白在生產運輸中的成本，同時保持其甜味效果，為甜味蛋白大規模工業化市場化打下基礎。采用PGAPZαA質粒可以將目的蛋白直接分泌到胞外，節省了后期純化成本，由于本身為GADPH自誘導型啟動子，發酵過程中不需要添加任何誘導劑，減少了發酵過程中的染菌概率，同時沒有任何有毒代謝物質，保證了該蛋白作為食品添加劑的安全。附圖說明圖1是80℃不同時間下熱處理蛋白電泳圖；圖2所示為85℃不同時間下熱處理蛋白電泳圖。圖中，1：未熱處理蛋白2：蛋白marker3：80℃熱處理2h4：80℃熱處理4h；5：80℃熱處理6h；6.80℃熱處理8h；7:80℃熱處理10h；8：85℃熱處理30min；9：85℃熱處理1h；10：85℃熱處理2h；11：85℃熱處理4h；12：85℃熱處理6h；13：85℃熱處理8h。具體實施方式：為了更好地理解本專利技術，下面用具體實例來詳細說明本專利技術的技術方案，但是本專利技術并不局限于此。實施例1單鏈monellin突變基因蛋白的制備(1)野生型單鏈monellin蛋白載體的構建由中美泰和生物技術有限公司合成野生型單鏈monellin全基因并在兩端分別引物XhoI和NotI兩個限制性內切酶位點，經過酶切目的基因片段和PGAPZαA空質粒，用T4DNA連接酶37℃連接過夜，轉化入DH5α大腸桿菌感受態細胞中涂布于含25μg/mlZeocin的LLB固體培養基上，過夜培養挑取陽性轉化子，用質粒提取試劑盒提取質粒測序驗證，成功構建野生型monellin蛋白載體PGAPZαA-SCM。(2)對野生型單鏈monellin蛋白定點突變針對突變位點設計一對特異性引物：上游P1：[5’-CCCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種具有強熱穩定性的甜味蛋白monellin突變體，其特征在于，將野生型單鏈monellin基因第23位氨基酸谷氨酸(Glu)定點突變為丙氨酸(Ala)。

【技術特征摘要】
1.一種具有強熱穩定性的甜味蛋白monellin突變體，其特征在于，將野生型單鏈
monellin基因第23位氨基酸谷氨酸(Glu)定點突變為丙氨酸(Ala)。
2.根據權利要求1所述的一種具有強熱穩定性的甜味蛋白monellin突變體，其特征在
于，與野生型單鏈monellin蛋白相比，甜味未下降，熱穩定性提高20℃。
3.如權利要求1所述的一種具有強熱穩定性的甜味蛋白monellin突變體的制備方法，
其特征在于，包括以下步驟：
(1)構建野生型單鏈monellin蛋白表達載體；
(2)將步驟(1)中進行定點突變得到突變基因，挑取陽性轉化子測序驗證；
(3)將步驟(2)中測序正確的質粒轉化入畢赤酵母中，篩選出成功轉化的畢赤酵母；
(4)在YPD培養基中誘導表達蛋白，時間為3天；
(5)將步驟(4)中表達的蛋白純化。
4.根據權利要求3所述的一種monellin蛋白突變體的制備方法，其特征在于，步驟(1)
為，構建含有野生型單鏈monellin蛋白基因的表達質粒PGAPZαA。
5.根據權利要求4所述的一種monellin蛋白突變體的制備方法，其特征在于，步驟(2)
突變位點特異性引物：上游P1：[5’-CCCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGGTGAA-3’]；下游P2：
[5’-CATACTGACCTATTTTG...

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉波，蔡成固，
申請(專利權)人：齊魯工業大學，
類型：發明
國別省市：山東;37