本發明專利技術提供了一種腫瘤抑制蛋白的變體，該變體是在SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸的基礎上，分別在53Y/F、60K/C、70P/V、79R/K、92R/K、97I/F、109A/S、131K/R、141A/P、204S/T、225E/A、232L/S、253K/V、270A/R、271A/S、297C/R、305G/S、322V/L、347L/R、379F/S、398Q/R、433Q/S或451L/V進行相應的取代。該蛋白變體相對于野生型具有更強的抑制腫瘤細胞生長的效果。這些變體蛋白質和它們的衍生物可以用于多種腫瘤的治療。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物
，具體地說，本專利技術涉及腫瘤抑制蛋白變體。
技術介紹
腫瘤相關蛋白DENND2D-v2，由468個氨基酸殘基組成，自序列4的氨基末端第47至145位氨基酸殘基為uDENN結構域，自序列4的氨基末端第146至330位氨基酸殘基為DENN結構域，自序列4的氨基末端第368至435位氨基酸殘基為dDENN結構域。該腫瘤相關蛋白在小鼠成纖維細胞內穩定高表達可以明顯抑制該細胞的惡性轉化；在mRNA水平檢測其在細胞系中的表達結果表明，肺癌細胞系中的表達水平顯著低于原代培養的正常支氣管上皮細胞；在肺癌臨床組織標本中檢測其表達水平結果表明，肺癌組織的表達水平明顯低于其周邊的正常組織。該腫瘤相關蛋白可用于腫瘤的體外診斷、預后。含有上述腫瘤相關蛋白編碼基因的重組真核表達載體在導入肺癌細胞系中后，能單獨引起肺癌細胞系的生長變緩及致瘤性減弱。因此，該蛋白具有較好的腫瘤藥物應用前景。在現有技術中，為了提高蛋白的活性，針對蛋白的活性位點進行特異性的突變和取代，從而尋找活性更高的變體是常規的做法。為了進一步提高該蛋白的生物活性，申請人通過大量的實驗，針對DENND2D-v2氨基酸序列中特定的位點進行了點突變，從而獲得了比DENND2D-v2蛋白本身具有更高抑制活性的變體。
技術實現思路
本專利技術涉及親本蛋白的分離的變體，其在至少一個對應于SEQIDNO:1的成熟多肽的位置53Y、60K、70P、79R、92R、97I、109A、131K、141A、204S、225E、232L、253K、270A、271A、297C、305G、322V、347L、379F、398Q、433Q或451L的位置包含修飾。具體而言，本專利技術的變體具有改善的抑制活性。優選地，應用于本專利技術的方法、呈現改善的抑制活性的蛋白變體包含至少1種任一下述修飾：53Y/F、60K/C、70P/V、79R/K、92R/K、97I/F、109A/S、131K/R、141A/P、204S/T、225E/A、232L/S、253K/V、270A/R、271A/S、297C/R、305G/S、322V/L、347L/R、379F/S、398Q/R、433Q/S、451L/V。本專利技術還涉及產生本專利技術的蛋白變體的方法，包括(a)培養宿主細胞；和(b)回收所述蛋白變體。在本專利技術的產生方法中，使用本領域熟知的方法在適合于產生所述多肽的營養培養基中培養細胞。例如，可以通過在合適培養基中和允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行的搖瓶培養，和實驗室或工業發酵罐中的小規?；虼笠幠０l酵(包括連續、分批、補料分批或固態發酵)來培養細胞。使用本領域已知的方法在合適的營養培養基中進行培養，所述營養培養基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養基能夠從商業供應商獲得或可以根據公開的組成制備(例如，在美國典型培養物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養培養基中，該多肽能夠從所述培養基中直接回收。如果多肽不分泌，其能夠從細胞裂解物(lysate)回收。所得多肽可以使用本領域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常規方法從營養培養基中回收，所述常規方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發或沉淀。本專利技術的多肽可以通過多種本領域已知的方法純化，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或提取(參見，例如，ProteinPurification,J.-C.Janson和LarsRyden編,VCHPublishers,NewYork,1989)。本專利技術的多肽用于制備相應的藥物，去用于治療癌癥。具體實施方式實施例1：DENND2D-v2基因的獲得DENND2D-v2：上游引物5’CACTCCAGGGGCCATGGATG3’下游引物5’GTCATTCTTATTCACCACAGCTC3’用上述引物，以人正常肺組織cDNA文庫(Clontech：K1420-1)為模板進行PCR擴增反應，反應條件如下：反應體積50μl，其中含有：用雙蒸水補足至50μl體積。反應溫度、時間：94℃，變性5分鐘；然后94℃變性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，擴增30個循環；最后在72℃下延伸10分鐘。擴增產物為3’帶有堿基A的3’突出粘端片段，用QIAquick膠回收試劑盒(Qiagen，28706)按產品說明書進行純化，然后與3’有堿基T的線性pGEM-TEASY載體(Promega，A1360)在16℃下連接8小時，使用2mm電極杯，2500V轉化大腸桿菌DH5α，轉化物在含氨芐青霉素的LB平板培養基上生長，挑選克隆，提取質粒，使用AbIPRISM3700DNA分析儀(Perkin-Elmer/AppliedBiosystem)測序，獲得DENND2D-v2基因的全長cDNA，長度為1905bp，其編碼序列是自序列的5′端第57至1463位脫氧核糖核苷酸，編碼468個氨基酸。實施例2：相應突變后的DENND2D-v2基因的獲得方法1.突變點的引入(1)根據相應的突變位點設計相應的誘變引物，采用PCR定點突變法在DENND2D-v2基因上把野生型對應的氨基酸位點進行突變；(2)上述PCR產物經膠回收純化后，用限制性內切酶進行酶切，與經過相同酶切的質粒pPIC9k片段連接后，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞；2.鑒定重組質粒：用酶切、PCR方法對重組質粒進行鑒定，并測序檢驗，由此得到突變后的核苷酸序列。實施例3、DENND2D-v2變體對肺癌細胞系H1299生長抑制作用將實施例2獲得的突變后的核苷酸序列回收后直接正向連入pcDNA3.1/V5-HisTOPOTA(Invitrogen，K4800)真核表達載體，經雙向測序和酶切鑒定無誤，得到正向插入突變后的核苷酸序列的cDNA基因質粒，命名為pcDNA3.1/V5-HisTOPOTA-DENND2D-v2，簡稱pcDB3.1-DENND2D-v2。1、細胞凋亡的觀察與檢測：(1)陽性對照質粒pcDB3.1-BAX質粒的構建pcDB3.1-BAX為凋亡實驗的陽性對照，按照下述方法構建：以人正常肺組織cDNA文庫(Clontech：K1420-1)為模板，利用Taq酶進行PCR反應擴增BAX的全長cDNA基因(GenbankNo.NM_138761)。瓊脂糖電泳回收PCR產物，本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種腫瘤抑制蛋白，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO：1所示。
【技術特征摘要】
1.一種腫瘤抑制蛋白，其氨基酸序列為SEQIDNO：1所示。
2.一種人腫瘤抑制蛋白變體，其特征在于，在SEQIDNO：1所示的氨基酸的基礎上，在
398Q/R...
【專利技術屬性】
技術研發人員：馬恒標，
申請(專利權)人：馬恒標，
類型：發明
國別省市：陜西;61
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