一種人尿液來源細胞的外泌體的獲取方法，是首先分離培養(yǎng)人尿液來源細胞并收集培養(yǎng)基，將人尿液來源細胞的培養(yǎng)基通過0.22微米濾膜過濾，以去除大的細胞殘片以及其它雜質(zhì)；然后離心除去細胞器，留取上清；再使用可截留100KD分子量的膜，通過離心截留上清中的外泌體，截留完成后，使用PBS對膜進行洗脫即得到外泌體濃縮液。本發(fā)明專利技術(shù)的外泌體可用于制備具有抗凋亡、促進血管新生、修復(fù)缺血損傷、促進細胞生長的藥物，以及用于治療皮膚缺損、皮膚潰瘍、褥瘡、骨缺損、骨不連、股骨頭壞死、腎損傷、缺血性損傷、脊髓損傷、胰島損傷、糖尿病及其并發(fā)癥、阿爾茨海默氏癥等。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物醫(yī)學(xué)，尤其涉及一種來源于人尿液細胞的外泌體的獲取方法與應(yīng)用。
技術(shù)介紹
近年的研究顯示細胞移植治療在修復(fù)各種組織器官損傷方面具有顯著的效果和廣闊的應(yīng)用前景。但是，直接移植細胞用于人體疾病治療還存在安全性、免疫排斥、成瘤隱患以及運輸儲存困難等諸多問題。近年的研究提示細胞發(fā)揮其修復(fù)組織損傷功能主要是通過旁分泌機制實現(xiàn)的，而旁分泌機制中細胞分泌的外泌體可能是細胞發(fā)揮功能的關(guān)鍵組分。外泌體為真核細胞的多泡體和胞膜融合后分泌到胞外的雙層膜包裹的結(jié)構(gòu)，它含有類似其來源細胞的胞膜成分、蛋白質(zhì)及各種RNA組分，通過與細胞膜發(fā)生融合或者以靶受體的方式結(jié)合，在細胞與細胞之間傳遞細胞因子、蛋白質(zhì)或者RNA等一系列生物活性物質(zhì)，從而使靶細胞發(fā)生一系列生物學(xué)效應(yīng)。最近的研究證實，人體多種細胞可分泌外泌體，人體體液中(血液、尿液、唾液、乳液)都含有外泌體，體外培養(yǎng)細胞的條件培養(yǎng)液中都存在由細胞分泌的外泌體；高效液相色譜分析證實不同細胞分泌的外泌體含有不同或不同劑量的蛋白質(zhì)；芯片檢測技術(shù)分析證實不同細胞分泌的外泌體含有不同或不同劑量的信使RNA和小RNA。因此，不同細胞來源的外泌體所發(fā)揮的生物學(xué)功能是不相同的，各有其獨特性。從尿液中分離培養(yǎng)細胞，具有來源方便、可以大量獲取、取材無創(chuàng)等優(yōu)勢。目前通過培養(yǎng)尿液來源細胞獲得其外泌體并用于修復(fù)組織損傷及治療疾病的方法尚未見報道。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的，就是為了提供一種來源于人尿液細胞的外泌體的獲取方法與應(yīng)用。為了達到上述目的，本專利技術(shù)采用了以下技術(shù)方案：一種來源于人尿液細胞的外泌體的獲取方法，首先分離培養(yǎng)人尿液來源細胞并收集培養(yǎng)基，將人尿液來源細胞的培養(yǎng)基通過0.22微米濾膜過濾，以去除大的細胞殘片以及其它雜質(zhì)；然后離心除去細胞器，留取上清；再使用可截留100KD分子量的膜，通過離心截留上清中的外泌體，截留完成后，使用PBS對膜進行洗脫即得到外泌體濃縮液。將外泌體濃縮液轉(zhuǎn)移至蔗糖/重水密度墊上離心分離，收集底部蔗糖/重水密度墊，加入兩倍體積PBS，轉(zhuǎn)移至可截留100KD分子的超濾細心管中離心分離；PBS洗滌3次，得到純化的外泌體懸液。所述離心除去細胞器是4℃、10000g離心30分鐘。所述離心截留上清中的外泌體是3500g離心15分鐘。所述蔗糖/重水密度墊的密度為1.210g/cm3，其中的蔗糖的重量百分含量為30％；所述轉(zhuǎn)移至蔗糖/重水密度墊上離心分離是4℃、100800g離心210分鐘；所述轉(zhuǎn)移至可截留100KD分子的超濾細心管中離心分離是4℃、3500g離心15分鐘。所述人尿液來源細胞包括直接從尿液中分離的細胞；從尿液中分離并在體外培養(yǎng)的細胞；從尿液中分離并在體外培養(yǎng)且經(jīng)過基因改造或藥物處理的細胞；以及通過藥物刺激引發(fā)泌尿系統(tǒng)細胞激活、游離至尿液中而獲得的細胞。所述外泌體的標志物為CD9、CD11b、CD54、CD63、CD81、CD82以及與人尿液來源細胞特性相應(yīng)的標志物。所述與人尿液來源細胞特性相應(yīng)的標志物包括CD146、CD34、CD24、CD133、SIX2、PAX2、WT1、LHX1或OSR1。來源于人尿液細胞的外泌體可用于制備具有抗凋亡、促進血管新生、修復(fù)缺血損傷、促進細胞生長藥物。來源于人尿液細胞的外泌體可用于治療皮膚缺損、皮膚潰瘍、褥瘡、骨缺損、骨不連、股骨頭壞死、腎損傷、缺血性損傷、脊髓損傷、胰島損傷、糖尿病及其并發(fā)癥、阿爾茨海默氏癥。來源于人尿液細胞的外泌體可用于制備成含有來源于人尿液細胞的外泌體的復(fù)合物，將外泌體通過錨定或注入載體表面或內(nèi)部，形成形狀固定、可供植入的復(fù)合物，復(fù)合物植入后，其中的外泌體緩釋或可控釋放；所述復(fù)合物包括各種假體或支架。來源于人尿液細胞的外泌體可用于制備成含有來源于人尿液細胞的外泌體的敷料，將外泌體通過錨定或注入載體表面或內(nèi)部，形成形狀固定的敷料，敷料與組織粘附后，其中的外泌體可緩釋、可控釋放至組織內(nèi)。來源于人尿液細胞的外泌體可用于制備成含有來源于人尿液細胞的外泌體的細胞培養(yǎng)添加劑，將外泌體懸液制備為細胞培養(yǎng)添加劑，用于細胞狀態(tài)的維持或誘導(dǎo)分化。附圖說明圖1是外泌體的TEM照片。圖2是可控電阻脈沖傳感技術(shù)測定的外泌體粒度分布。圖3是WesternBlot檢測到的外泌體表面標志物。圖4是復(fù)合人尿液來源細胞的外泌體的材料植入組14天后皮膚各部分組織的修復(fù)情況。圖5是對照組14天后皮膚各部分組織的修復(fù)情況。圖6是假手術(shù)組14天后皮膚各部分組織的修復(fù)情況。圖7、圖8是各組大鼠尿量和UACR比較，與Normal組比較，*P<0.05；與Diabetes比較，#P<0.05。圖9-圖15是流式細胞術(shù)檢測HPDC凋亡結(jié)果。圖16是HPDC在高糖誘導(dǎo)72小時后Caspase-3的蛋白表達水平。具體實施方式申請人已經(jīng)建立從尿液中分離、擴增細胞的方法，并收集人尿液來源細胞(Urine-derivedCells,UCs)的技術(shù)體系。本專利技術(shù)人尿液來源細胞的外泌體的獲取方法，是使用不同孔徑的膜結(jié)構(gòu)、通過離心截留UCs培養(yǎng)基中的外泌體。培養(yǎng)基首先通過0.22微米孔徑濾膜過濾，以去除大的細胞殘片、以及其它可能存在的雜質(zhì)；然后，4℃10000g離心30分鐘，除去細胞器，留取上清；使用可截留100KD分子量的膜、通過離心(3500g，15min)截留上清中的外泌體。截留完成后，使用PBS對膜進行洗脫即得到外泌體濃縮液。將濃縮液轉(zhuǎn)移至6ml30％蔗糖/重水密度墊(1.210g/cm3)，4℃100800g離心210分鐘，收集底部5ml蔗糖/重水密度墊，加入兩倍體積PBS，轉(zhuǎn)移至可截留100KD分子的超濾細心管中，4℃3500g離心15min；PBS洗滌3次，最終按后續(xù)實驗要求定容至一定體積，得到外泌體懸液，分裝保存至-80℃環(huán)境中。外泌體可由透射電子顯微鏡觀察(參見圖1)，其粒度分布由可控電阻脈沖傳感技術(shù)測定(參見圖2)，直徑范圍50-150nm。其在懸液中可聚集為二聚體、乃至多聚體，因而粒度分布檢測結(jié)果中亦包含200-300nm數(shù)據(jù)。其膜結(jié)構(gòu)表面含有CD9、CD11b、CD54、CD63、CD81、CD82等標志物(參見圖3)，以及與人尿液來源細胞特性相應(yīng)的標志物(可包含但不限于CD146，CD34，CD24，CD133，SIX2，PAX2，WT1，LHX1，OSR1)。其膜結(jié)構(gòu)內(nèi)包含蛋白、肽段、核酸等具有<本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種來源于人尿液細胞的外泌體的獲取方法，其特征在于，首先分離培養(yǎng)人尿液來源細胞并收集培養(yǎng)基，將人尿液來源細胞的培養(yǎng)基通過0.22微米濾膜過濾，以去除大的細胞殘片以及其它雜質(zhì)；然后離心除去細胞器，留取上清；再使用可截留100KD分子量的膜，通過離心截留上清中的外泌體，截留完成后，使用PBS對膜進行洗脫即得到外泌體濃縮液。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種來源于人尿液細胞的外泌體的獲取方法，其特征在于，首先分離培養(yǎng)
人尿液來源細胞并收集培養(yǎng)基，將人尿液來源細胞的培養(yǎng)基通過0.22微米濾膜過
濾，以去除大的細胞殘片以及其它雜質(zhì)；然后離心除去細胞器，留取上清；再使用
可截留100KD分子量的膜，通過離心截留上清中的外泌體，截留完成后，使用PBS
對膜進行洗脫即得到外泌體濃縮液。
2.如權(quán)利要求1所述的來源于人尿液細胞的外泌體的獲取方法，其特征在于：
將外泌體濃縮液轉(zhuǎn)移至蔗糖/重水密度墊上離心分離，收集底部蔗糖/重水密度墊，
加入兩倍體積PBS，轉(zhuǎn)移至可截留100KD分子的超濾離心管中離心分離；PBS洗
滌3次，得到純化的外泌體懸液。
3.如權(quán)利要求1或2所述的來源于人尿液細胞的外泌體的獲取方法，其特征
在于：所述人尿液來源細胞包括直接從尿液中分離的細胞；從尿液中分離并在體外
培養(yǎng)的細胞；從尿液中分離并在體外培養(yǎng)且經(jīng)過基因改造或藥物處理的細胞；以及
通過藥物刺激引發(fā)泌尿系統(tǒng)細胞激活、游離至尿液中而獲得的細胞。
4.如權(quán)利要求1所述的來源于人尿液細胞的外泌體的獲取方法，其特征在于：
所述外泌體的標志物為CD9、CD11b、CD54、CD63、CD81、CD82以及與人尿液
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：汪泱，牛鑫，張長青，李青，胡斌，姜珍珍，
申請(專利權(quán))人：上海市第六人民醫(yī)院，汪泱，
類型：發(fā)明
國別省市：上海;31
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