一種用于動物用滅活疫苗的乳化方法技術

本發明專利技術涉及一種用于動物用滅活疫苗的乳化方法。本發明專利技術技術突破了乳化后按國家標準檢測無分層，但放置于2～8℃保存時易分層的瓶頸，先分別以低免胚制備三種抗原，混勻三種抗原后滅活，并加入甘氨酸和硫柳汞作為水相，不同比例的白油、吐溫?80和司本?80混勻后過濾除菌作為油相，水相油相經低溫剪切乳化后，粒徑D90小于等于1.0，黏度值為10～100cP，2～8℃保存24個月后，所制備的三聯滅活疫苗未發現分層，效力檢驗合格。說明本發明專利技術可以制備出穩定、均一、安全、高效的新城疫、傳染性支氣管炎和禽流感H9亞型三聯滅活疫苗。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種用于動物用滅活疫苗的乳化方法，屬于動物生物制品領域。
技術介紹
新城疫、傳染性支氣管炎和禽流感H9亞型三種疾病近年來的爆發，成為危害養雞業健康發展的三大重要傳染病，每年給養禽業都造成了巨大的經濟損失。而疫苗是這三大疫病最重要有效的防控手段。新城疫A-VII株和禽流感WJ57株是現流行毒株的代表株，傳染性支氣管炎M41是經典疫苗株，相應單苗、聯苗及三聯苗的面世，對于三大疫病的防控都將具有積極的社會與經濟意義。但在滅活疫苗的制備過程當中，乳化工序中乳化劑的選擇、配方和乳化方式不合適，均可導致滅活疫苗劑型不穩定，不僅影響外觀及臨床應用效果，嚴重的會破乳，產生不可逆的性狀改變，導致疫苗無法使用。乳化完成后，按照中國獸藥典的方法：取10ml疫苗，以3000r/min離心15min，不分層為合格。剛乳化完成的懸乳液，用此法檢測時極少會出現分層或破乳，但在2～8℃保存7～30天左右會出現分層現象。為解決乳化后保存在2～8℃條件下疫苗分層的現象，本專利技術擬用新的乳化劑配方和乳化方式，合適的親水親油值，在低溫狀態下進行乳化，制備出穩定、均勻、安全和高效的預防新城疫、傳染性支氣管炎和禽流感(H9亞型)相關滅活疫苗。
技術實現思路
本專利技術的目的在于突破乳化后易分層的問題，提供一種用于動物用滅活疫苗的乳化方法。該方法可以制備出穩定、均勻、安全和高效的動物用滅活疫苗。使其粒徑D90小于等于1.0，黏度值為10～100cP，且在2～8℃條件下，保存24個月不分層，效力檢驗合格。對于新城疫(A-VII株)、禽流感(WJ57株)、傳染性支氣管炎(M41株)滅活疫苗及相應聯苗的大規模生產中的重要環節乳化來說，是個非常大的改進和突破。為了實現上述指標，本專利技術采取了如下技術方案：一種用于動物用滅活疫苗的乳化方法，該方法包括如下步驟：(1)新城疫病毒A-VII株：毒種用無菌PBS做適當稀釋，尿囊腔接種9～11日齡低免雞胚，每胚103.0～106.0EID50/0.1ml。選接種后48～96小時死亡的雞胚，置2～8℃冷卻12～24小時，收獲雞胚液于專業滅菌容器中，每0.1ml病毒液的病毒含量≥108.5EID50，備用；傳染性支氣管炎病毒M41株：毒種用無菌PBS做適當稀釋，尿囊腔接種9～11日齡低免雞胚，每胚102.0～104.0EID50/0.1ml。選接種后24～48小時死亡的雞胚，置2～8℃冷卻12～24小時，收獲雞胚液于專業滅菌容器中，每0.1ml病毒液的病毒含量≥106.5EID50，備用；禽流感H9亞型病毒WJ57株：毒種用無菌PBS做適當稀釋，尿囊腔接種9～11日齡低免雞胚，每胚103.0～106.0EID50/0.1ml。選接種后48～72小時后的雞胚，置2～8℃冷卻12～24小時，收獲雞胚液于專業滅菌容器中，每0.1ml病毒液的病毒含量≥108.5EID50，備用；(2)將上述收獲的新城疫病毒抗原、傳染性支氣管炎病毒抗原和禽流感H9亞型病毒抗原以一定的比例混合成水相，加入濃度為0.1％～0.25％的甲醛，于37℃，1000～2000r/min攪拌，滅活16～24小時；(3)滅活完成后，加入甘氨酸和硫柳汞，混勻成水相；(4)將白油，吐溫-80和司本-80按一定比例混合成油相，無菌過濾；(5)乳化容器放置于冰浴中，在容器中加入油相3份，2000r/min剪切攪拌，在剪切過程中緩慢加入1份水相，當水相加完后，攪拌剪切的速度調整至5000～9000r/min，攪拌5～10min；(8)乳化完成后，測定粒徑和黏度；(9)在2～8℃保存24個月后，所制備的三聯滅活疫苗未發現分層，效力檢驗合格。2.權利要求1所述一種用于動物用滅活疫苗的乳化方法，其特征在于該方法用于制備單一抗原成分的滅活疫苗和兩種抗原成分的二聯滅活疫苗。具體實施方式本專利技術采用低免胚作為制備抗原的雞胚，新城疫病毒A-VII株、傳染性支氣管炎病毒M41株、禽流感H9亞型病毒WJ57株作為種毒，分別制備抗原，將三種抗原以1:1:1的比例混合后滅活，在抗原混合液中加入甘氨酸和硫柳汞作為水相，不同比例的白油、吐溫-80和司本-80混勻后過濾除菌，作為油相，3份油相與1份水相在冰浴條件下進行剪切乳化，并包括如下步驟：(1)抗原制備新城疫病毒A-VII株：毒種用無菌PBS做適當稀釋，尿囊腔接種9～11日齡低免雞胚，每胚103.0～106.0EID50/0.1ml。選接種后48～96小時死亡的雞胚，置2～8℃冷卻12～24小時，收獲雞胚液于專業滅菌容器中，每0.1ml病毒液的病毒含量≥108.5EID50，備用；傳染性支氣管炎病毒M41株：毒種用無菌PBS做適當稀釋，尿囊腔接種9～11日齡低免雞胚，每胚102.0～104.0EID50/0.1ml。選接種后24～48小時死亡的雞胚，置2～8℃冷卻12～24小時，收獲雞胚液于專業滅菌容器中，每0.1ml病毒液的病毒含量≥106.5EID50，備用；禽流感H9亞型病毒WJ57株：毒種用無菌PBS做適當稀釋，尿囊腔接種9～11日齡低免雞胚，每胚103.0～106.0EID50/0.1ml。選接種后48～72小時后的雞胚，置2～8℃冷卻12～24小時，收獲雞胚液于專業滅菌容器中，每0.1ml病毒液的病毒含量≥108.5EID50，備用；(2)滅活將上述收獲的新城疫病毒抗原、傳染性支氣管炎病毒抗原和禽流感H9亞型病毒抗原以一定的比例混合成水相，加入濃度為0.1％～0.25％的甲醛，于37℃，1000～2000r/m攪拌，滅活16～24小時；(3)水相滅活完成后，加入甘氨酸和硫柳汞，混勻成水相；(4)油相將白油，吐溫-80和司本-80按一定比例混合成油相，無菌過濾；(5)乳化乳化容器放置于冰浴中，在容器中加入油相3份，2000r/min剪切攪拌，在剪切過程中緩慢加入1份水相，當水相加完后，攪拌剪切的速度調整至5000～9000r/min，攪拌5～10min；(8)測定乳化完成后，測定粒徑和黏度；(9)保存期在2-8℃保存24個月后，所制備的三聯滅活疫苗未發現分層，效力檢驗合格；本專利技術所述新城疫病毒毒株為A-VII株，傳染性支氣管炎毒株為M41株，禽流感病毒毒株為WJ57株；本專利技術所述甘氨酸濃度為0.1％～1.0％，硫柳汞的濃度為0.1％～1.0％。本專利技術所述油相中白油含量為70％～85％，吐溫-80含量為12.5％～20％，司本-80的含量為2.5％～10％；本專利技術所述油相與水相比例為3:1，親水親油值為6.7～7.6之間；本專利技術所述乳化后的均勻乳液粒徑D90小于等于1.0，黏度值為10～100cP。附圖說明圖1本專利技術乳化后疫苗測定的D90為0.46μm。圖2疫苗性狀(2-a：常規乳化工序；2-b：本專利技術乳化工序)。圖中顯示：2～8℃保存24個月的檢驗結果所制備的三聯滅活疫苗未發現分層(圖2b)、效力檢驗合格。本專利技術所涉及的生物材料資源信息本專利技術所述新城疫病毒(Newcastilediseasevirus)基因VII型新城疫病毒致弱株A-NDV-VII(CGMCCNO.2141)，本專利技術稱：A-VII株，購自揚州大學，(參見：中國專利：ZL200710131863，基因Ⅶ型新城疫病毒致弱株A-NDV本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于動物用滅活疫苗的乳化方法，其特征在于該方法包括如下步驟：(1)新城疫病毒A?VII株：毒種用無菌PBS做適當稀釋，尿囊腔接種9～11日齡低免雞胚，每胚103.0～106.0EID50/0.1ml。選接種后48～96小時死亡的雞胚，置2～8℃冷卻12～24小時，收獲雞胚液于專業滅菌容器中，每0.1ml病毒液的病毒含量≥108.5EID50，備用；傳染性支氣管炎病毒M41株：毒種用無菌PBS做適當稀釋，尿囊腔接種9～11日齡低免雞胚，每胚102.0～104.0EID50/0.1ml。選接種后24～48小時死亡的雞胚，置2～8℃冷卻12～24小時，收獲雞胚液于專業滅菌容器中，每0.1ml病毒液的病毒含量≥106.5EID50，備用；禽流感H9亞型病毒WJ57株：毒種用無菌PBS做適當稀釋，尿囊腔接種9～11日齡低免雞胚，每胚103.0～106.0EID50/0.1ml。選接種后48～72小時后的雞胚，置2～8℃冷卻12～24小時，收獲雞胚液于專業滅菌容器中，每0.1ml病毒液的病毒含量≥108.5EID50，備用；(2)將上述收獲的新城疫病毒抗原、傳染性支氣管炎病毒抗原和禽流感H9亞型病毒抗原以一定的比例混合成水相，加入濃度為0.1％～0.25％的甲醛，于37℃，1000～2000r/min攪拌，滅活16～24小時；(3)滅活完成后，加入甘氨酸和硫柳汞，混勻成水相；(4)將白油，吐溫?80和司本?80按一定比例混合成油相，無菌過濾；(5)乳化容器放置于冰浴中，在容器中加入油相3份，2000r/min剪切攪拌，在剪切過程中緩慢加入1份水相，當水相加完后，攪拌剪切的速度調整至5000～9000r/min，攪拌5～10min；(8)乳化完成后，測定粒徑和黏度；(9)在2～8℃保存24個月后，所制備的三聯滅活疫苗未發現分層、效力檢驗合格。...

【技術特征摘要】
1.一種用于動物用滅活疫苗的乳化方法，其特征在于該方法包括如下步驟：(1)新城疫病毒A-VII株：毒種用無菌PBS做適當稀釋，尿囊腔接種9～11日齡低免雞胚，每胚103.0～106.0EID50/0.1ml。選接種后48～96小時死亡的雞胚，置2～8℃冷卻12～24小時，收獲雞胚液于專業滅菌容器中，每0.1ml病毒液的病毒含量≥108.5EID50，備用；傳染性支氣管炎病毒M41株：毒種用無菌PBS做適當稀釋，尿囊腔接種9～11日齡低免雞胚，每胚102.0～104.0EID50/0.1ml。選接種后24～48小時死亡的雞胚，置2～8℃冷卻12～24小時，收獲雞胚液于專業滅菌容器中，每0.1ml病毒液的病毒含量≥106.5EID50，備用；禽流感H9亞型病毒WJ57株：毒種用無菌PBS做適當稀釋，尿囊腔接種9～11日齡低免雞胚，每胚103.0～106.0EID50/0.1ml。選接種后48～72小時后的雞胚，置2～8℃冷卻12～24小...

【專利技術屬性】
技術研發人員：何海蓉，王正春，陳堅，王秋娟，
申請(專利權)人：中崇信諾生物科技泰州有限公司，
類型：發明
國別省市：江蘇;32