一種用于清除循環(huán)腫瘤細(xì)胞的免疫吸附劑制造技術(shù)

一種用于清除血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的免疫吸附劑，所述的免疫吸附劑，以天然高分子為載體，以生物交聯(lián)劑或化學(xué)交聯(lián)劑為手臂，以循環(huán)腫瘤細(xì)胞特異性抗原的單克隆或多克隆抗體為配基，通過生物或化學(xué)的合成方法將載體?手臂?配基結(jié)合，制備得到具有特異性清除血液中腫瘤細(xì)胞的免疫吸附劑。本發(fā)明專利技術(shù)通過將腫瘤特異性抗原的單克隆或多克隆抗體偶聯(lián)到吸附劑載體上，透過血液灌流的方式，特異性清除血液中的腫瘤細(xì)胞，達(dá)到治療或預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移目的。

Immune adsorbent for clearing circulating tumor cells

A method for removal of blood circulating tumor cells immune adsorbent, the immune adsorbent, with natural polymer as the carrier, the biological crosslinking agent or chemical crosslinking agent as the arm, to circulating tumor cell specific antigen monoclonal or polyclonal antibody as the ligand, synthesized by biological or chemical carrier arm ligand binding, prepared with specific immune adsorbent to remove tumor cells in the blood. The coupling of tumor specific antigen monoclonal or polyclonal antibody to the adsorbent carrier, through the blood perfusion method, specific removal of tumor cells in the blood, to treat or prevent cancer metastasis.

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于生物醫(yī)藥
，涉及一種基于體外循環(huán)，用于清除血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的免疫吸附劑。技術(shù)背景轉(zhuǎn)移是癌癥的主要病理特征之一，是癌癥致死的重要原因，腫瘤轉(zhuǎn)移90％以上是通過血液轉(zhuǎn)移而發(fā)生，因此，必須阻斷或延緩腫瘤細(xì)胞經(jīng)血液轉(zhuǎn)移的途徑。當(dāng)前，癌癥已成為繼心腦血管疾病之后的人類第二死因，2000年，世界共有癌癥新發(fā)病例1040萬，死亡病例650萬；預(yù)計(jì)到2030年，這些數(shù)字將大幅上升，新發(fā)病例將達(dá)到2640萬，死亡病例達(dá)到1640萬。目前，我國每年約有300萬癌癥新發(fā)病例，死亡病例200萬。調(diào)查表明：“腫瘤病人死亡，90％是腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移導(dǎo)致，還有一部分是因?yàn)椴∪说钠渌l(fā)癥，腫瘤并發(fā)癥往往也都和腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，因此腫瘤轉(zhuǎn)移始終是腫瘤防治的重大課題及研究難點(diǎn)?！笔中g(shù)、放療、化療是當(dāng)前腫瘤治療的主要手段，手術(shù)可切除已形成腫塊的癌細(xì)胞，放療、化療可以殺死全部或部分成年癌細(xì)胞，而對未成熟癌細(xì)胞作用較小。放、化療的副作用使病人的免疫功能更為低下，反而誘導(dǎo)幼年癌細(xì)胞從休眠狀態(tài)被激活，迅速裂變、突變、形成新的成年癌細(xì)胞，這就是癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的根本原因?；熕幬锏陌邢蛐圆蛔?，致使化療藥物不僅殺傷腫瘤細(xì)胞，也殺傷正常細(xì)胞，從而降低了患者機(jī)體的免疫功能，甚至直接摧毀患者的免疫系統(tǒng)，影響化療的治療效果。臨床經(jīng)驗(yàn)表明，在腫瘤患者的免疫力未恢復(fù)之前，單純通過直接殺死癌細(xì)胞的治療方法不僅是徒勞的，而且是有害的，其結(jié)果是加速了患者的死亡！世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，對比1990年與2000年十年間的腫瘤患者死亡率，不僅沒有下降，反而上升了17％的實(shí)際數(shù)據(jù)，得出了為什么醫(yī)學(xué)科技水平越來越先進(jìn)，腫瘤治療技術(shù)和藥物也越來越多，而腫瘤患者的死亡率卻不降反升的結(jié)論：因?yàn)槲覀冞€沒有真正認(rèn)識腫瘤，還沒有找到根治腫瘤的利器！生物技術(shù)的進(jìn)步，使生物療法(Biotherapy,BT)成為繼手術(shù)、化療、放療之后的第四種腫瘤療法，該療法于80年代開始應(yīng)用于臨床治療，其通過提高患者自體免疫力來治療腫瘤，抑制其生長或是減輕其它療法所帶來的副作用。單克隆抗體的出現(xiàn)，將生物療法提升到更高的高度，單抗藥物在非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌以及結(jié)直腸癌的治療中已經(jīng)發(fā)揮了重要的作用。但是單抗療法也具有自身的缺陷，非人源型抗體的免疫原性、腫瘤抗原的異質(zhì)性、昂貴的費(fèi)用等都是急需要解決的重要問題。血液凈化療法在臨床疑難重癥如肝衰竭、自身免疫性疾病、極性中毒等的治療中發(fā)揮著越來越重要的作用，也有望成為癌癥治療中的第五種療法。體外循環(huán)凈化系統(tǒng)用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞清除專利較少，主要基于腫瘤細(xì)胞大小(201410137735.9)來實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的分離，但這種基于大小分離腫瘤細(xì)胞的方式，效率較低，臨床應(yīng)用也存在諸多困難。也有人采用納米磁珠偶聯(lián)抗體來分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CN102258818A)，但納米磁珠的分離及納米材料的潛在毒性，是臨床應(yīng)用所面臨的重要問題。針對以上療法所面臨的不足，有必要開發(fā)出一種簡單、適宜于臨床應(yīng)用的循環(huán)腫瘤細(xì)胞清除裝置，用以輔助治療癌癥。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種可用于清除血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的超大孔免疫吸附劑。本專利技術(shù)技術(shù)方案本專利技術(shù)提供的用于體外全血灌流以清除血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的免疫吸附劑，以天然高分子或合成高分子為載體，以生物交聯(lián)劑或化學(xué)交聯(lián)劑為手臂，以腫瘤細(xì)胞表面特異性抗原的單克隆或多克隆抗體為配基，通過生物或化學(xué)的合成方法將載體-手臂-配基結(jié)合，制備得到具有特異性清除血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的免疫吸附劑。所述的天然高分子載體是絲素蛋白、殼聚糖或絲素蛋白與殼聚糖的復(fù)合物的超大孔微球。因?yàn)樗麄兙哂休^好的生物相容性，容易制成超大孔球狀載體，其含有大量供反應(yīng)的活性位點(diǎn)(羥基或胺基等)。所述的吸附劑載體為球形，粒徑在100-1000um，以400-800um范圍最佳。平均孔徑在10-50um之間，以15-30范圍最佳。所述的生物交聯(lián)劑是具有異型雙功能基的交聯(lián)劑，具體是DPS(3,3'-二硫代二丙酸二(N-羥基丁二酰亞胺酯)、DCC(二環(huán)己基碳化二亞胺)或PMPI(N-[p-Maleimidophenyl]isocyanate)等；化學(xué)交聯(lián)劑是戊二醛或乙二胺。所述的單克隆或多克隆抗體，是來源于目前所知的所有腫瘤表面抗原的抗體，特別是來源于循環(huán)腫瘤細(xì)胞所表達(dá)的特異性抗原的抗體，包括但不限于Ep-CAM、EGFR、Vimentin、MUC16、PSA等。所述的免疫吸附劑載體上，單克隆或多克隆抗體配基的含量10-50ug/g(濕球)。所述的生物或化學(xué)的合成方法，是指目前通過文獻(xiàn)可知的所有合成方法和反應(yīng)條件。本專利技術(shù)提供的免疫吸附劑可用于全血灌流清除血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞。該吸附劑不僅可以用于清除循環(huán)血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，也可以用于術(shù)后預(yù)防癌癥的轉(zhuǎn)移。本專利技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：本專利技術(shù)通過將腫瘤表面特異性抗原的單克隆或多克隆抗體偶聯(lián)到吸附劑載體上，通過血液灌流的方式，特異性清除血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，可降低腫瘤經(jīng)血液途徑轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。具體實(shí)施方式本專利技術(shù)所涉及免疫吸附劑可以通過以下方式實(shí)現(xiàn)：①吸附劑載體微球制備：將絲素蛋白或/和殼聚糖按一定比例溶于水或醇-水溶液中，通過相轉(zhuǎn)化法制備吸附劑載體微球。②吸附劑載體手臂接枝：將一定濃度的交聯(lián)劑溶液，加入到一定量吸附劑載體的容器內(nèi)，一定條件下進(jìn)行反應(yīng)，制備得到帶有活性手臂的吸附劑載體微球。③免疫吸附劑的制備：將一定濃度的腫瘤抗體(Ep-CAM，EGFR等)溶液，加入到裝有一定量帶有活性手臂吸附劑的容器內(nèi)，一定條件下進(jìn)行反應(yīng)，制備得到免疫吸附劑。本專利技術(shù)將血液凈化技術(shù)應(yīng)用到癌癥復(fù)發(fā)的預(yù)防與治療領(lǐng)域，通過將單克隆抗體偶聯(lián)到吸附劑載體上，避免了異源性抗體用于腫瘤治療所引起的免疫反應(yīng)，也避免了放、化療對正常免疫系統(tǒng)的損害，通過抗原-抗體特異性識別作用，清除血液中的癌細(xì)胞，減少原發(fā)性癌癥因血液轉(zhuǎn)移而造成的轉(zhuǎn)移癌的發(fā)生，為癌癥治療提供了一種輔助治療方法。實(shí)施例1殼聚糖載體微球制備：取殼聚糖10g，加200ml含1％醋酸的水溶液中，該溶液經(jīng)18號針頭被泵入到含有8％(Wt％)NaOH的水溶液中，經(jīng)相轉(zhuǎn)化過程，即制備得到殼聚糖載體微球，微球粒徑在300-500um之間，平均孔徑在20um。免疫吸附劑制備：取上述殼聚糖載體微球10g，加入預(yù)先配制好的1mg/ml濃度的DPS(3,3'-二硫代二丙酸二(N-羥基丁二酰亞胺酯)20ml，室溫反應(yīng)30分鐘，吸棄反應(yīng)液，PBS清洗3次，每次5分鐘，即得到具有可與抗體鍵合的活性載體微球，然后將預(yù)先配制好的10ug/ml的EGFR溶液20ml，和活性載體微球在25℃反應(yīng)1小時(shí)，得到EGFR配基免疫吸附劑，載體上配基的含量為20ug/g(濕球)，即免疫吸附劑1。循環(huán)腫瘤細(xì)胞吸附試驗(yàn)：取一定量非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞(預(yù)先用活細(xì)胞染料DiI標(biāo)記)500個(gè)，加入到含10ml正常人血液的已肝素化的50ml離心管中，然后再加入上述制備的EGFR配基的免疫吸附劑1ml，緩慢震蕩(30次/分鐘)60分鐘，取上清，于熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)顯紅色熒光的細(xì)胞數(shù)，結(jié)果見表1。實(shí)施例2：絲素蛋白載體微球制備：取經(jīng)脫脂處理的絲素蛋白10g，溶于200ml的水溶液中，該溶液經(jīng)18號針頭被泵入到含有液氮的容器中，經(jīng)相轉(zhuǎn)化制備得到球形本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于體外全血灌流以清除血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的免疫吸附劑，其特征在于，該吸附劑以天然高分子或合成高分子為載體，以生物交聯(lián)劑或化學(xué)交聯(lián)劑為手臂，以腫瘤細(xì)胞特異性抗原的單克隆或多克隆抗體為配基，通過生物或化學(xué)的合成方法將載體?手臂?配基結(jié)合，制備得到具有特異性清除血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的免疫吸附劑。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于體外全血灌流以清除血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的免疫吸附劑，其特征在于，該吸附劑以天然高分子或合成高分子為載體，以生物交聯(lián)劑或化學(xué)交聯(lián)劑為手臂，以腫瘤細(xì)胞特異性抗原的單克隆或多克隆抗體為配基，通過生物或化學(xué)的合成方法將載體-手臂-配基結(jié)合，制備得到具有特異性清除血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的免疫吸附劑。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫吸附劑，其特征在于所述的天然高分子載體是絲素蛋白、殼聚糖或由殼聚糖與絲素蛋白構(gòu)成的復(fù)合物的超大孔微球，微球粒徑在100-1000um之間，平均孔徑在10-50um之間。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫吸附劑，其特征在于所述的生物交聯(lián)劑是具有異型雙功能基的交聯(lián)劑，具體是DPS(3,3'-二硫代二丙酸二(N-...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：溫珍珍，李文忠，歐來良，
申請(專利權(quán))人：天津普拉德生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：天津;12