一種轉(zhuǎn)化外源長(zhǎng)鏈ssRNA到煙曲霉未萌發(fā)孢子中的方法技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)公開(kāi)了一種轉(zhuǎn)化外源長(zhǎng)鏈ssRNA到煙曲霉未萌發(fā)孢子中的方法，包括煙曲霉培養(yǎng)和孢子收集、煙曲霉孢子預(yù)處理以及使用HDEN法電擊煙曲霉孢子三個(gè)步驟，該方法繞過(guò)真菌孢子萌發(fā)這個(gè)步驟，采用HDEN電轉(zhuǎn)化技術(shù)，將體外的單鏈編碼蛋白R(shí)NA遞送穿過(guò)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，在煙曲霉休眠孢子內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)方法步驟簡(jiǎn)便快速，效果極佳，轉(zhuǎn)化率達(dá)到90%以上。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專(zhuān)利技術(shù)屬于生物
，具體涉及一種轉(zhuǎn)化外源長(zhǎng)鏈ssRNA到煙曲霉未萌發(fā)孢子中的方法。
技術(shù)介紹
分子生物學(xué)的中心法則是指遺傳信息從DNA傳遞給RNA，再?gòu)腞NA傳遞給蛋白質(zhì)，即完成遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯的過(guò)程。現(xiàn)代基因工程中，常常使用宿主來(lái)表達(dá)外源蛋白，常用的做法就是構(gòu)建質(zhì)粒載體，把外源蛋白的編碼DNA序列放在一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子后面，導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，編碼DNA序列被轉(zhuǎn)錄成mRNA序列(單鏈RNA)，mRNA序列又被細(xì)胞內(nèi)的翻譯機(jī)器表達(dá)成蛋白質(zhì)分子，完成外源蛋白表達(dá)的全過(guò)程。DNA不論是作為游離于宿主基因組之外的質(zhì)粒，還是插入到宿主基因組之中，都可以穩(wěn)定地復(fù)制自身，并傳遞給子代。也就是說(shuō)，DNA的信息可以遺傳。同時(shí)，DNA可以源源不斷地轉(zhuǎn)錄出新生RNA，并翻譯成蛋白質(zhì)。RNA由核糖核苷酸經(jīng)磷酸二酯鍵縮合而成長(zhǎng)鏈狀分子。一個(gè)核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和堿基構(gòu)成。RNA的堿基主要有4種，即A(腺嘌呤)、G(鳥(niǎo)嘌呤)、C(胞嘧啶)、U(尿嘧啶)。RNA作為單鏈分子，與雙鏈結(jié)構(gòu)的DNA相比，RNA很不穩(wěn)定，半衰期很短，而且在自然界，RNA酶廣泛存在，RNA非常容易被降解。RNA具有以下眾所周知的特征：游離在細(xì)胞質(zhì)的RNA不會(huì)遺傳；RNA半衰期很短，不能長(zhǎng)期存在；RNA不會(huì)插入到宿主的基因組DNA中。由于半衰期短，因此，一個(gè)RNA分子存在于細(xì)胞內(nèi)的時(shí)長(zhǎng)，也很短暫，該RNA只能在這個(gè)短暫的時(shí)間內(nèi)，與核糖體相互作用，表達(dá)蛋白質(zhì)分子。而被表達(dá)出來(lái)的蛋白質(zhì)分子，也是有壽命的，一個(gè)蛋白質(zhì)分子在細(xì)胞內(nèi)存在多久，也可以用半衰期指標(biāo)來(lái)衡量。在傳統(tǒng)的基因工程技術(shù)中，如果要在一個(gè)宿主細(xì)胞內(nèi)部表達(dá)外源的蛋白質(zhì)，常用的做法是把蛋白質(zhì)的編碼基因構(gòu)建在DNA載體上，把DNA載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞內(nèi)部，DNA載體源源不斷地轉(zhuǎn)錄出編碼蛋白質(zhì)的RNA，RNA不斷翻譯出目的蛋白，實(shí)現(xiàn)了在細(xì)胞內(nèi)的蛋白表達(dá)。如果不借助DNA載體，在體外制備編碼蛋白的單鏈RNA分子，僅僅把編碼蛋白質(zhì)的外源單鏈RNA導(dǎo)入到宿主細(xì)胞內(nèi)部，只要細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有對(duì)應(yīng)的DNA源源不斷地轉(zhuǎn)錄出新的該RNA，那么，這個(gè)RNA與其所表達(dá)出的蛋白質(zhì)分子，只能在特定的時(shí)間窗口存在。換言之,這個(gè)RNA與其所表達(dá)出的蛋白質(zhì)分子，只能在細(xì)胞生命周期中的某一個(gè)時(shí)間段存在。因此，這個(gè)特性有個(gè)很重要的作用，可以在特定的時(shí)間周期窗口，瞬時(shí)表達(dá)某個(gè)蛋白或者RNA，可以實(shí)現(xiàn)表達(dá)蛋白質(zhì)而不影響或者盡可能少影響細(xì)胞的正常生理周期和遺傳信息。比如：可以在細(xì)胞生命活動(dòng)的某個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)，轉(zhuǎn)入外源RNA，表達(dá)某個(gè)細(xì)胞因子，調(diào)控細(xì)胞的生命周期；可以把TALENs、ZFNs和CRISPR/Cas9等GenomeEditing的工具酶蛋白分子，用外源單鏈RNA在宿主細(xì)胞內(nèi)做表達(dá)，避免使用質(zhì)粒或其它DNA形式的載體時(shí)，將DNA序列引入細(xì)胞內(nèi)部，并造成潛在的外源DNA與宿主染色體相互作用(例如同源重組)，影響細(xì)胞的遺傳，等等。這個(gè)特性在基因工程領(lǐng)域，具有重要價(jià)值。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，已經(jīng)有先例，可以把外源單鏈RNA直接轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。主要方法包括：1，使用諸如Lipo等試劑的化學(xué)法，Lipo等化學(xué)試劑可以與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞膜發(fā)生相互作用，把外源RNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)部。2，傳統(tǒng)的電轉(zhuǎn)化法，比如方波電擊，這是一種用電脈沖短暫作用于接觸外源RNA的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，使外源RNA進(jìn)入細(xì)胞。煙曲霉可以生產(chǎn)煙曲霉素，它既具抗生素活性，又有抑制血管生成作用，從而具有對(duì)腫瘤的治療作用。煙曲霉還可以生產(chǎn)阿魏酸酯酶等各種酶制劑，是一種重要的工業(yè)發(fā)酵菌種。但是在這種真菌未萌發(fā)孢子中表達(dá)蛋白質(zhì)非常困難，為了對(duì)其進(jìn)行基因工程開(kāi)發(fā)，需要在其細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源蛋白。真菌孢子是真菌的主要繁殖器官，孢子呈休眠狀態(tài)且可以生存很長(zhǎng)時(shí)間。孢子在適宜的外界條件下，能夠蘇醒并萌發(fā)，形成菌絲而進(jìn)行分裂繁殖。最為重要的是，很多類(lèi)型真菌的孢子，是天然的單倍體，孢子是基因工程領(lǐng)域良好的起始生物材料。但是，由于孢子一般處于休眠狀態(tài)，其細(xì)胞壁非常厚實(shí)，休眠孢子的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的狀態(tài)，與萌發(fā)孢子、與菌絲體是不同的。且休眠孢子細(xì)胞內(nèi)的生命活動(dòng)也處于最不旺盛的狀態(tài)，因此，本領(lǐng)域公知，休眠孢子的細(xì)胞通透性不如萌發(fā)孢子和菌絲，休眠孢子幾乎不與外界交流物質(zhì)，閉關(guān)鎖國(guó)，一般處于睡眠狀態(tài)。而萌發(fā)孢子或菌絲體，需要從外界吸收各種營(yíng)養(yǎng)分子供給生命活動(dòng)，因此細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性大于休眠孢子。所以，非常難以將外源RNA分子直接導(dǎo)入到睡眠孢子的內(nèi)部。目前也尚未有任何方法可以做到直接把外源RNA分子在無(wú)介質(zhì)介導(dǎo)的情況下，導(dǎo)入休眠的(未萌發(fā))真菌孢子內(nèi)部。這也是本行業(yè)內(nèi)一直沒(méi)有攻克的技術(shù)難題。目前尚未有把外源單鏈RNA導(dǎo)入煙曲霉細(xì)胞內(nèi)部的報(bào)道，更沒(méi)有把外源RNA導(dǎo)入煙曲霉孢子(無(wú)論是萌發(fā)孢子，還是未萌發(fā)孢子)的報(bào)道。目前用基因工程技術(shù)在煙曲霉細(xì)胞內(nèi)表達(dá)目的蛋白質(zhì)的方法，仍然需要借助DNA載體，且一般需要使用煙曲霉成熟菌絲體的原生質(zhì)體作為宿主細(xì)胞，或者借助農(nóng)桿菌作為介質(zhì)，用DNA載體運(yùn)載基因信息進(jìn)入宿主細(xì)胞。此外，編碼蛋白質(zhì)的外源RNA導(dǎo)入未萌發(fā)孢子內(nèi)部后，還需要與孢子內(nèi)部的蛋白翻譯因子等各種細(xì)胞因子、酶系相互作用，才能翻譯出蛋白質(zhì)分子。但是，眾所周知，睡眠孢子的生命活動(dòng)處于最不旺盛的狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)各種蛋白翻譯因子和酶系的活力是很低的，各種因子和酶系分子的數(shù)量也是很少的，即便外源RNA進(jìn)入了未萌發(fā)孢子內(nèi)部，也需要比較長(zhǎng)的相互作用時(shí)間，才能翻譯出目的蛋白。而時(shí)間長(zhǎng)，就意味著外源RNA在細(xì)胞內(nèi)，被細(xì)胞內(nèi)源性RNA酶降解的概率加大，因此，就要求要有足夠多數(shù)量的外源RNA，可以進(jìn)入未萌發(fā)孢子內(nèi)部。如何讓真菌的孢子萌發(fā)，本領(lǐng)域已經(jīng)有現(xiàn)成的技術(shù)方案，但是無(wú)論哪種萌發(fā)方法，都需要消耗時(shí)間、精力、人工操作、以及化學(xué)試劑。業(yè)內(nèi)已經(jīng)有用萌發(fā)的真菌孢子，導(dǎo)入外源DNA的案例，因此，按照本領(lǐng)域的基礎(chǔ)理論，一般認(rèn)為，用細(xì)胞通透性更強(qiáng)的萌發(fā)孢子導(dǎo)入外源分子(例如外源的RNA)的成功率更大，因?yàn)槊劝l(fā)的孢子已經(jīng)蘇醒，細(xì)胞內(nèi)各種因子和酶系已經(jīng)充分調(diào)動(dòng)和活躍起來(lái)了，細(xì)胞要吸收養(yǎng)分，細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交流活躍。可惜的是，目前為止，尚未有用孢子(無(wú)論是萌發(fā)還是未萌發(fā))導(dǎo)入外源編碼RNA的先例。但是，顯而易見(jiàn)，用未萌發(fā)的孢子來(lái)作為導(dǎo)入外源分子的起始材料，非常簡(jiǎn)便，因?yàn)榭梢允∪プ鲦咦用劝l(fā)這一復(fù)雜的步驟，更重要的是，萌發(fā)的孢子，可能已經(jīng)產(chǎn)生了多倍體，而未萌發(fā)的孢子，可以保證是單倍體，很多基因工程的應(yīng)用，要求宿主細(xì)胞必須是單倍體，才能達(dá)到預(yù)想的結(jié)果或者效率。因此本專(zhuān)利技術(shù)嘗試?yán)@過(guò)真菌孢子萌發(fā)這個(gè)步驟，直接用休眠的孢子，來(lái)導(dǎo)入外源RNA。另外，眾所周知真菌能產(chǎn)生大量的RNA酶，并且能夠大量外分泌這些RNA酶，真菌是自然界RNA酶的主要來(lái)源之一。真菌孢子采集自菌體，采集真菌孢子時(shí)，孢子會(huì)攜帶有菌體分泌的大量的外源性RNA酶，而且很難在不殺滅孢子的情況下，把RNA酶徹底清洗干凈(如果使用DEPC等化合物來(lái)做徹底清洗，勢(shì)必會(huì)殺滅真菌孢子)。而且孢子自身也會(huì)產(chǎn)生和外分泌一些RNA酶。因此，使用外源單鏈RNA來(lái)轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞，非常困難，無(wú)異于雞蛋碰石頭，單鏈RNA還未接觸到真菌細(xì)胞就會(huì)被RNA酶降解了。綜上所述，將編碼蛋白質(zhì)的RNA分子，直接導(dǎo)入真菌(無(wú)論是菌絲體還是孢子，無(wú)論是萌發(fā)的孢本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種轉(zhuǎn)化外源長(zhǎng)鏈ssRNA到煙曲霉未萌發(fā)孢子中的方法，其特征在于：所述方法包括以下步驟：1）煙曲霉培養(yǎng)和孢子收集在固體瓊脂培養(yǎng)基表面接種煙曲霉，培養(yǎng)至培養(yǎng)基表面長(zhǎng)滿(mǎn)煙曲霉孢子，洗下培養(yǎng)基表面的煙曲霉孢子，吸出孢子懸液并過(guò)濾去除菌絲，收集含有孢子的濾液，將濾液離心，收集沉淀的休眠孢子；2）煙曲霉孢子預(yù)處理用電擊緩沖液重懸孢子，離心并收集孢子沉淀，重復(fù)上述重懸和離心步驟3?4次后，將最后收集的孢子沉淀重懸于電擊緩沖液中，得到孢子濃度為104?1011個(gè)/ml的煙曲霉孢子懸液；所述電擊緩沖液由終濃度為0.01?100mmol/L的4?羥乙基哌嗪乙磺酸和終濃度為0.5?5000mmol/L的甘露醇組成，電擊緩沖液的pH為3.0?9.5；3）使用HDEN法電擊煙曲霉孢子在細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中加入上述步驟得到的煙曲霉孢子懸液以及待轉(zhuǎn)化RNA，混勻，得到孢子與RNA混合物，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于冰上冰浴10?15min，然后采用Etta?Biotech?X?Porator?H1電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行HDEN法電擊，將帶有矩陣式電極的電擊頭插入孢子與RNA混合物內(nèi)部，通電，使得孢子與RNA混合物內(nèi)部產(chǎn)生電場(chǎng)，電擊之后再將細(xì)胞培養(yǎng)板置于冰上冰浴10?15min，然后將孢子和RNA混合物吸出，得到導(dǎo)入外源ssRNA的休眠的煙曲霉孢子；所述煙曲霉懸液與待轉(zhuǎn)化RNA的比例為：0.6?60000μl的煙曲霉孢子懸液：0.1?10000μg的待轉(zhuǎn)化RNA；所述電擊參數(shù)如下：電壓1?6000V，脈寬2?2000000ms，重復(fù)1?100次，每次間隔5?50000ms。...

【技術(shù)特征摘要】
1.一種轉(zhuǎn)化外源長(zhǎng)鏈ssRNA到煙曲霉未萌發(fā)孢子中的方法，其特征在于：所述方法包括以下步驟：1）煙曲霉培養(yǎng)和孢子收集在固體瓊脂培養(yǎng)基表面接種煙曲霉，培養(yǎng)至培養(yǎng)基表面長(zhǎng)滿(mǎn)煙曲霉孢子，洗下培養(yǎng)基表面的煙曲霉孢子，吸出孢子懸液并過(guò)濾去除菌絲，收集含有孢子的濾液，將濾液離心，收集沉淀的休眠孢子；2）煙曲霉孢子預(yù)處理用電擊緩沖液重懸孢子，離心并收集孢子沉淀，重復(fù)上述重懸和離心步驟3-4次后，將最后收集的孢子沉淀重懸于電擊緩沖液中，得到孢子濃度為104-1011個(gè)/ml的煙曲霉孢子懸液；所述電擊緩沖液由終濃度為0.01-100mmol/L的4-羥乙基哌嗪乙磺酸和終濃度為0.5-5000mmol/L的甘露醇組成，電擊緩沖液的pH為3.0-9.5；3）使用HDEN法電擊煙曲霉孢子在細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中加入上述步驟得到的煙曲霉孢子懸液以及待轉(zhuǎn)化RNA，混勻，得到孢子與RNA混合物，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于冰上冰浴10-15min，然后采用EttaBiotechX-PoratorH1電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行HDEN法電擊，將帶有矩陣式電極的電擊頭插入孢子與RNA混合物內(nèi)部，通電，使得孢子與RNA混合物內(nèi)部產(chǎn)生電場(chǎng)，電擊之后再將細(xì)胞培養(yǎng)板置于冰上冰浴10-15min，然后將孢子和RNA混合物吸出，得到導(dǎo)入外源ssRNA的休眠的煙曲霉孢子；所述煙曲霉懸液與待轉(zhuǎn)化RNA的比例為：0.6-60000μl的煙曲霉孢子懸液：0.1-10000μg的待轉(zhuǎn)化RNA；所述電擊參數(shù)如下：電壓1-6000V，脈寬2-2000000ms，重復(fù)1-100次，每次間隔5-50000ms。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種轉(zhuǎn)化外源長(zhǎng)鏈ssRNA到煙曲霉未萌發(fā)孢子中的方法，其特征在于：所述步驟1）的培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基或察氏培養(yǎng)基。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種轉(zhuǎn)化外源長(zhǎng)鏈ssRNA到煙曲霉未萌發(fā)孢子中的方法，其特征在于：所述步驟1，）煙曲霉的培養(yǎng)條件為：溫度16-40℃，濕度15-85%，培養(yǎng)3-15日。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種轉(zhuǎn)化外源長(zhǎng)鏈ssRNA到煙曲霉未萌發(fā)孢子中的方法，其特征在于：所述步驟2）...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：林峻，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：福州大學(xué)，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：福建;35