本發明專利技術公開了一種用于國槐離體葉片體胚誘導快繁的成套培養基，包括芽啟動培養基、試管苗增殖培養基、體細胞胚誘導培養基、不定芽誘導培養基、壯苗培養基和生根培養基，使用本發明專利技術培養基繁殖國槐幼苗，再生率高、出芽多，植株移栽成活率可達到95％以上，種苗生長健壯，不但可有效解決優良種苗種質退化問題，還可為國槐遺傳轉化或誘變育種提供一個理想的受體系統。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種用于國槐離體葉片體胚誘導快繁的成套培養基。
技術介紹
國槐(SophorajaponicaLinn)，別名家槐、中國槐，屬蝶形花亞科、槐屬。國槐為落葉喬木，樹勢優美，花期較長，極耐修剪，耐寒、耐旱、耐空氣污染，又是吉祥、幸福、美好的象征，是理想的行道樹種和庭院綠化樹種，而且國槐材質優良，花、果實、根皮、樹皮可入藥，種子可榨油制皂，具有較高的經濟價值，應用前景十分廣闊。目前，國槐是嫁接龍爪槐、金枝槐、聊紅槐、蝴蝶槐等觀賞品種的唯一砧木樹種，苗木需求大。國槐主要以種子繁殖為主，但其開花結果具有大小年現象，且種子易受病蟲害危害，干癟、空洞現象嚴重。常規的育種方法，依靠種子或扦插繁殖，難以滿足生產的需求，基于此有必要對國槐進行組培快繁研究，提供優質、大量國槐種苗，切實解決國槐苗木需求的瓶頸。國槐古樹資源歷經千百年的風霜歲月，具有最原始的長壽和抗逆基因，但由于各種原因，衰老死亡的現象時常發生。就古槐衰敗的現狀來看，常表現為樹干腐朽空洞、冠形殘缺、頂梢枯萎、枝葉凋零、病蟲害嚴重、根系生長不良等等。這些古槐是大自然和前人留給我們的寶貴的基因資源。近年來，利用生物轉基因技術培育具有抗性如抗逆、抗蟲、抗病等新型品種是國槐育種的新趨勢。到目前為止，對槐樹的形成層培養、莖培養、葉片培養、胚培養、未授粉子房的培養均已獲得了完整的植株，對原生質的培養也取得了一定的進展。袁秀云等利用國槐的子葉和下胚軸產生了不定芽，王喆之等利用花藥培養形成了單倍體植株，HanK.H等(1993，1997)將直徑為0.5～1.0cm的枝條消毒后，取出形成層接入愈傷誘導培養基中誘導愈傷，再將愈傷組織轉入分化培養基中，獲得了叢生芽，將成苗轉入生根培養基中，可誘導生根。上述的方法存在的缺點：由于國槐為多年生木本植物，其再生率普遍較低，出芽少，直接影響了國槐的遺傳轉化。利用植物體胚誘導技術不但能達到保存母株優良基因、快速繁育的目的，還是提高基因遺傳轉化或誘變育種的重要途徑。目前，有關國槐的體細胞胚誘導技術研究的較少，可以參考的現有技術比較少。國槐為多年生喬木，基因組龐大，鑒于基因型的限制，其他物種的體細胞胚誘導的繁殖技術對國槐沒有參考價值。在這一方面，即使是同一物種，不同的品種之間，體胚誘導培養基也不相同。例如，同樣是國槐，同一種培養基，對黃金槐適合，對金葉槐就不適合。專利CN102499086A公開了一種刺槐的繁殖方法，以不同胚齡的合子胚為外植體，以MS+2，4-D+BA+蔗糖+瓊脂為胚性愈傷組織的誘導培養基；以MS基本培養基+MES+谷氨酰胺+水解酪蛋白+萘乙酸+6-芐氨基腺嘌呤+蔗糖+瓊脂為體細胞胚誘導培養基，通過對愈傷組織的誘導，形成球形胚后將其轉接到MS+水解酪蛋白培養基上，進行體細胞胚的成熟培養，然后轉接到MS基本培養基上萌發形成完整小植株。該專利使用刺槐的不同胚齡的合子胚(莢果)作為原料進行體細胞培養，不論是刺槐還是國槐，其每年的花期以及果實期都是固定的兩個月左右，所以在進行體細胞培養時具有時間的局限性；國槐的離體葉片、不成熟的合子胚均可誘導產生胚狀體。但是，在山東地區，最近幾年的國槐小峰危害非常嚴重，很難采到無蟲害的完整種子。其次，相對于國槐葉片誘導來說，不成熟合子胚的誘導時間更長，且誘導出的叢生芽也不如葉片誘導的多。因此，本專利采用取材方便、誘導率高的葉片進行國槐體胚誘導。國槐與刺槐分屬不同的屬，物種差別較大，不能參考莢果的體細胞培養得到葉片的體細胞培養。
技術實現思路
本專利技術的目的就是為了解決上述問題，提供一種用于國槐離體葉片體胚誘導快繁的成套培養。為了實現上述目的，本專利技術采用如下技術方案：一種用于國槐離體葉片體胚誘導快繁的成套培養基，包括芽啟動培養基、試管苗增殖培養基、體細胞胚誘導培養基、不定芽誘導培養基、壯苗培養基和生根培養基，其中：所述芽啟動培養基是指：MS+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8～6.0；所述試管苗增殖培養基是指：MS+1.0～2.0mg/LBA+1.0～2.0mg/LIBA+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8～6.0；所述體細胞胚誘導培養基是指：MS+3.0～5.0mg/L2,4-D+0.5～1.0mg/LBA+0.5～1.0mg/LNAA+0.1～0.5mg/LTDZ+0.5～1.0mg/L谷氨酰胺+0.5～1.0mg/LCH(水解酪蛋白)+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8～6.0；所述不定芽誘導培養基是指:MS+0.1～0.5mg/LBA+0.1～0.5mg/LNAA+0.5～1.0mg/L谷氨酰胺+0.5～1.0mg/LCH(水解酪蛋白)+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8～6.0；所述壯苗培養基MS+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8～6.0；所述生根培養基是指：1/2MS+0.1～0.5mg/LIBA+0～0.05mg/LNAA+5.0g/L瓊脂+20g/L蔗糖,pH值5.8～6.0；所述1/2MS指的是MS全量減半。所述MS包括常量營養元素、微量營養元素和有機試劑。所述的常量營養元素的組分和其對應的濃度如下：硝酸鉀1900mg/L，硝酸銨1650mg/L，七水硫酸鎂370mg/L，無水磷酸二氫鉀170mg/L，二水氯化鈣440mg/L，乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L，七水硫酸亞鐵27.8mg/L。所述的微量營養元素的組分和其對應的濃度如下：四水硫酸錳22.3mg/L，硫酸鋅8.6mg/L，硼酸6.2mg/L，碘化鉀0.83mg/L，鉬酸鈉0.25mg/L，硫酸銅0.025mg/L，氯化鈷0.025mg/L。所述的有機試劑的組分和其對應的濃度如下：鹽酸硫胺素10mg/L，煙酸1.0mg/L，鹽酸吡哆醇1.0mg/L，肌醇100mg/L。有益效果：體細胞胚發生的因素包括內因和外因，內因包括物種和基因型，外因主要涉及培養基中附加成分的種類和濃度。即使是同一屬的植物，由于基因型不同，體細胞胚發生頻率相差極大，原因如下:一是不同基因型體細胞胚發生頻率不同，二是不同基因型的最適誘導條件不同。外植體的生理狀態和發育程度都直接影響體細胞胚的發生，一般生理代謝旺盛而分化程度較低的組織有利于體細胞胚的誘導。對于培養基中必需的生長素、細胞分裂素、赤霉素、脫落酸，還原性氮鹽和外源氨基酸，pH值等其他因素，他們的作用方向、作用程度都不相同。誘導植物體細胞胚發生的因素眾多，但它們的作用程度不盡相同，各種因子通過轉錄與翻譯水平復雜而精確地調控，使體細胞胚發生的相關基因在時間上和空間上得以選擇性激活和表達，只有各種因素配合使用時才能快速、高效地誘導出體細胞胚。外植體的生理狀態和發育程度都直接影響體細胞胚的發生，一般生理代謝旺盛而分化程度較低的組織有利于體細胞胚的誘導，葉片相較于花芽、花藥、子葉、子房中的合子胚，各種單細胞，游離的小孢子、原生質體以及體細胞胚本身的分化程本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種用于國槐離體葉片體胚誘導快繁的成套培養基，其特征是：包括芽啟動培養基、試管苗增殖培養基、體細胞胚誘導培養基、不定芽誘導培養基、壯苗培養基和生根培養基，其中：所述芽啟動培養基是指：MS+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8～6.0；所述試管苗增殖培養基是指：MS+1.0～2.0mg/LBA+1.0～2.0mg/LIBA+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8～6.0；所述體細胞胚誘導培養基是指：MS+3.0～5.0mg/L?2,4?D+0.5～1.0mg/L?BA+0.5～1.0mg/L?NAA+0.1～0.5mg/L?TDZ+0.5～1.0mg/L谷氨酰胺+0.5～1.0mg/L?CH(水解酪蛋白)+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8～6.0；所述不定芽誘導培養基是指:MS+0.1～0.5mg/L?BA+0.1～0.5mg/L?NAA+0.5～1.0mg/L谷氨酰胺+0.5～1.0mg/L?CH(水解酪蛋白)+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8～6.0；所述壯苗培養基MS+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8～6.0；所述生根培養基是指：1/2MS+0.1～0.5mg/L?IBA+0～0.05mg/L?NAA+5.0g/L瓊脂+20g/L蔗糖,pH值5.8～6.0；所述1/2MS指的是MS全量減半。...
【技術特征摘要】
1.一種用于國槐離體葉片體胚誘導快繁的成套培養基，其特征是：包括芽啟動培養基、
試管苗增殖培養基、體細胞胚誘導培養基、不定芽誘導培養基、壯苗培養基和生根培養基，
其中：
所述芽啟動培養基是指：MS+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8～6.0；
所述試管苗增殖培養基是指：MS+1.0～2.0mg/LBA+1.0～2.0mg/LIBA+5.0g/L瓊脂+30g/L
蔗糖,pH值5.8～6.0；
所述體細胞胚誘導培養基是指：MS+3.0～5.0mg/L2,4-D+0.5～1.0mg/LBA+0.5～
1.0mg/LNAA+0.1～0.5mg/LTDZ+0.5～1.0mg/L谷氨酰胺+0.5～1.0mg/LCH(水解酪蛋
白)+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8～6.0；
所述不定芽誘導培養基是指:MS+0.1～0.5mg/LBA+0.1～0.5mg/LNAA+0.5～1.0mg/L
谷氨酰胺+0.5～1.0mg/LCH(水解酪蛋白)+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8～6.0；
所述壯苗培養基MS+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖,pH值5.8～6.0；
所述生根...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李雙云，劉盛芳，李自成，劉桂民，安連任，馮建華，夏陽，龐彩紅，
申請(專利權)人：山東省林業科學研究院，
類型：發明
國別省市：山東;37
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