一種活體在線檢測植物生長素的微電極生物傳感器及其應用制造技術

本發明專利技術涉及微電極生物傳感技術，具體公開了一種活體在線檢測植物生長素的微電極生物傳感器。本發明專利技術通過在金(或鉑)工作電極上修飾IAA的抗體實現對IAA的特異性識別，通過在電極上沉積金納米粒子及修飾IAA?金納米粒子復合物實現IAA的高靈敏檢測。本發明專利技術通過對活體植物體內IAA的在線連續檢測，原位實時的掌握植物體內生長素的動態變化信息，了解IAA的代謝過程，為了解IAA參與植物生命體系的調控機理提供理論依據。應用微型生物傳感器實現對植物活體內IAA的在線連續檢測，對被檢測樣本不造成本質傷害；得到的數據結果可實時動態的反映植物體內IAA的含量變化，實際應用操作簡便，易于掌握。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及微電極生物傳感技術，具體地說，涉及一種活體在線檢測植物生長素的微電極生物傳感器。
技術介紹
作為植物體內的一種小分子有機物，生長素(IAA)主要參與植物的生長及發育過程。生長素對植物胚芽鞘尖端、幼嫩的芽、葉等的誘導通常具有正負兩重性，主要取決于其濃度和植物的生理狀況。通常情況下，過多的生長素會促進植物體內乙烯的產生，打亂植物內部的生理平衡，從而抑制植物的生長。另一方面，植物果實的發育離不開生長素。種子在發育過程中，產生的生長素能夠改變其營養物質的分配，使子房發育為果實。目前，常用的生長素檢測方法主要有酶免疫(ELISA)檢測法、放射免疫分析(RIA)法、高效液相色譜(HPLC)法、氣相色譜(GC)法等。除此之外，近年來，光譜法、電化學法等也被應用于生長素的檢測。但目前的檢測方法都是破壞植物樣本的離體檢測，僅能反應某一時間點的靜態濃度或累積效應。傳統檢測方法需對樣品取樣進行分離提純等預處理，不僅操作繁瑣、耗時成本高，對樣本的破壞性較大，而且只能離體取樣檢測，無法體現樣本內IAA含量的實時動態變化。植物體內的生長素的含量極少且生長素周圍共存基體成分非常復雜，其含量易受光照條件、水分以及溫度等外界條件的影響，因此，隨著研究的深入，研究者更希望獲得植物適應外界環境時生長素的實時動態變化。
技術實現思路
為了解決現有技術中存在的問題，本專利技術的目的是提供一種活體在線檢測植物生長素的微電極生物傳感器及其應用。為了實現本專利技術目的，本專利技術的技術方案如下：第一方面，本專利技術提供了一種活體在線檢測植物生長素的微電極生物傳感器，所述微電極生物傳感器中工作電極的制備方法包括如下步驟：S1、將金工作電極或鉑工作電極浸入HAuCl4溶液中，在工作電極上經電化學沉積得到AuNPs修飾的工作電極；S2、在S1所得的工作電極上滴涂巰基十一酸(MUA)，使MUA通過Au–S鍵組裝到S1所得的工作電極上；S3、在S2所得的工作電極上滴涂含有N羥基琥珀酸亞胺(NHS)和1-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)的混合溶液，激活MUA的羧基；S4、在S3所得的工作電極上滴涂AuNPs-抗IAA復合物，得到IAA抗體修飾的工作電極；S5、在S4所得的工作電極上滴涂K3Fe(CN)6媒介體。為了更好地實現工作電極對IAA檢測的靈敏度和特異性，本專利技術對工作電極的修飾條件進行進一步的優化，具體如下：S1、將金工作電極或鉑工作電極浸入含0.5～1MKNO3的2-5mMHAuCl4溶液中，在工作電極上-0.4V電化學沉積200s得到AuNPs修飾的工作電極；S2、在S1所得的工作電極上滴涂1～5mM巰基十一酸(MUA)，孵育1～2h后用水沖去多余未反應的MUA，使MUA通過Au–S鍵組裝到S1所得的工作電極上；S3、在S2所得的工作電極上滴涂含有50mMN羥基琥珀酸亞胺和1-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(200mM)的混合溶液，孵育1-2h后，激活MUA的羧基；所述N羥基琥珀酸亞胺和1-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的混合溶液中N羥基琥珀酸亞胺與1-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的摩爾濃度比為1:1～1:4；S4、在S3所得的工作電極上滴涂AuNPs-抗IAA復合物，孵育1～4h得到IAA抗體修飾的工作電極；S5、在S4所得的工作電極上滴涂5～10mMK3Fe(CN)6媒介體。作為優選，所述工作電極最佳的制備方法包括：S1、將金工作電極或鉑工作電極浸入含1MKNO3的3mMHAuCl4溶液中，在工作電極上-0.4V電化學沉積200s得到AuNPs修飾的工作電極；S2、在S1所得的工作電極上滴涂2mM巰基十一酸(MUA)，孵育1h后用水沖去多余未反應的MUA，使MUA通過Au–S鍵組裝到S1所得的工作電極上；S3、在S2所得的工作電極上滴涂含有N羥基琥珀酸亞胺和1-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的混合溶液，孵育1-2h后，激活MUA的羧基；所述混合溶液中，N羥基琥珀酸亞胺的濃度為50mM，1-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的濃度為200mM；S4、在S3所得的工作電極上滴涂AuNPs-抗IAA復合物，孵育1h得到IAA抗體修飾的工作電極；S5、在S4所得的工作電極上滴涂5mMK3Fe(CN)6媒介體。本專利技術首先在金工作電極上沉積了金納米粒子，研究發現，電極上沉積金納米粒子后，可以顯著增加電極的表面積，從而大大提高檢測的靈敏度。其次，本專利技術對HAuCl4溶液的濃度進行了優化，發現HAuCl4濃度在2～5mM時效果較好，其中3mM的效果最好。在此基礎上，本專利技術對電化學沉積的條件進行了優化，在-0.4V電化學沉積200s能夠使AuNPs沉積的更加均勻，從而提高檢測的靈敏度。而后，本專利技術在金納米粒子修飾的工作電極上滴涂了巰基十一酸(MUA)以提供羧基，并對其濃度進行了優化，發現1-5mM的MUA效果較好，濃度太低不足以覆蓋電極表面，太高則影響電極的導電性，進而降低檢測性能，其中2mM的效果最好。進一步在電極上滴涂NHS和EDC的混合溶液，以激活羧基。NHS和EDC的濃度比為1：1-1:4，其中1:4效果最好。然后將AuNPs-抗IAA復合物滴涂到工作電極上，孵育1-4h得到IAA抗體修飾的工作電極。利用IAA的抗體實現對IAA的特異性檢測，而AuNPs-抗IAA復合物則可進一步增強檢測信號，從而提高檢測的靈敏度。進一步地，S4中所述AuNPs-抗IAA復合物的制備方法為：通過檸檬酸鈉還原法制備金納米粒子，將金納米粒子溶液的pH調節至7.6，在400μL金納米粒子溶液中加入100μL抗IAA的抗體(1mg/ml)，震蕩5min后，于4℃孵育12h；然后將混合物在4℃、12000rpm離心30min，以除去未連接的抗體；之后將沉淀分散于1ml含1％BSA、pH7.4的PBS緩沖液中，形成AuNPs-抗IAA復合物。進一步地，所述微電極生物傳感器還包括Ag/AgCl參比電極和鉑對電極。進一步地，為了使所述微電極生物傳感器適用于植物活體的在線檢測，避免離體檢測對樣品的破壞和取樣過程中樣品的變化和損失，本專利技術采用針式微電極，微電極通過涂膜、蝕刻技術等微機電加工(MEMS)技術制作，在硅片基質上制備上述工作電極、Ag/AgCl參比電極和鉑對電極，其外觀具有穿透植物組織的能力，長度約為30～50mm。第二方面，本專利技術提供了所述微電極生物傳感器在活體在線檢測植物生長素方面的應用。所述植物包括林木、花卉、蔬菜、農作物等，所述植物組織為植物的莖、葉、果實。進一步地，本專利技術提供一種活體在線檢測植物生長素的方法，所述方法包括：1)將所述微電極生物傳感器連接至電化學工作站，與IAA的標準溶液反應，通過電化學循環伏安法確定反應電壓為0.2V；然后將微電極與不同濃度的IAA的標準溶液反應，在0.2V工作電壓下通過計時電流法進行連續檢測，將峰電流值與IAA的濃度值作圖，制備標準曲線；2)將微電極生物傳感器插入待測植物組織，連接電化學工作站，在0.2V工作電壓下，通過計時電流法檢測被測部位的電流I，通過與步驟1)所述的標準曲線的方程對比，計算得到待測組織的實時IAA濃度。在本專利技術的一個具體實施方式中，選擇黃豆幼苗的莖稈為材料，活體檢測IAA含量。將微電極生物傳感器插入黃豆幼苗的莖稈部位進行活體檢測，并與電化學工作站相本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種活體在線檢測植物生長素的微電極生物傳感器，其特征在于，所述微電極生物傳感器中工作電極的制備方法包括如下步驟：S1、將金工作電極或鉑工作電極浸入HAuCl4溶液中，經電化學沉積得到AuNPs修飾的工作電極；S2、在S1所得的工作電極上滴涂MUA，使MUA通過Au–S鍵組裝到S1所得的工作電極上；S3、在S2所得的工作電極上滴涂含有N羥基琥珀酸亞胺和1?3?乙基碳二亞胺鹽酸鹽的混合溶液，激活MUA的羧基；S4、在S3所得的工作電極上滴涂AuNPs?抗IAA復合物，得到IAA抗體修飾的工作電極；S5、在S4所得的工作電極上滴涂K3Fe(CN)6媒介體。

【技術特征摘要】
1.一種活體在線檢測植物生長素的微電極生物傳感器，其特征在于，所述微電極生物傳感器中工作電極的制備方法包括如下步驟：S1、將金工作電極或鉑工作電極浸入HAuCl4溶液中，經電化學沉積得到AuNPs修飾的工作電極；S2、在S1所得的工作電極上滴涂MUA，使MUA通過Au–S鍵組裝到S1所得的工作電極上；S3、在S2所得的工作電極上滴涂含有N羥基琥珀酸亞胺和1-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的混合溶液，激活MUA的羧基；S4、在S3所得的工作電極上滴涂AuNPs-抗IAA復合物，得到IAA抗體修飾的工作電極；S5、在S4所得的工作電極上滴涂K3Fe(CN)6媒介體。2.根據權利要求1所述的微電極生物傳感器，其特征在于，所述微電極生物傳感器中工作電極的制備方法包括如下步驟：S1、將金工作電極或鉑工作電極浸入含0.5～1MKNO3的2-5mMHAuCl4溶液中，在工作電極上-0.4V電化學沉積200s得到AuNPs修飾的工作電極；S2、在S1所得的工作電極上滴涂1～5mMMUA，孵育1～2h后用水沖去多余未反應的MUA，使MUA通過Au–S鍵組裝到S1所得的工作電極上；S3、在S2所得的工作電極上滴涂含有N羥基琥珀酸亞胺和1-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的混合溶液，孵育1-2h后，激活MUA的羧基；所述N羥基琥珀酸亞胺和1-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的混合溶液中N羥基琥珀酸亞胺與1-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的摩爾濃度比為1:1～1:4；S4、在S3所得的工作電極上滴涂AuNPs-抗IAA復合物，孵育1～4h得到IAA抗體修飾的工作電極；S5、在S4所得的工作電極上滴涂5～10mMK3Fe(CN)6媒介體。3.根據權利要求2所述的微電極生物傳感器，其特征在于，所述微電極生物傳感器中工作電極的制備方法包括如下步驟：S1、將金工作電極或鉑工作電極浸入含1MKNO3的3mMHAuCl4溶液中，在工作電極上-0.4V電化學沉積200s得到AuNPs修飾的工作電極；S2、在S1所得的工作電極上滴涂2mMMUA，孵育1h后用水沖去多余未反應的MUA，使MUA通過Au–S鍵組裝到S1所得的工作電極上；S3、在S2所得的工作電極上滴涂含有N羥基琥珀酸...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王曉冬，李愛學，李璇，王成，胡葉，侯佩臣，潘大宇，路文超，何璐璐，張晗，
申請(專利權)人：北京農業信息技術研究中心，
類型：發明
國別省市：北京;11